【目的】探究核糖体蛋白L36A(ribosomal protein L36A,RPL36A)基因对PK15细胞增殖过程的影响,为解析马身猪和大白猪生长速度差异的生理机制奠定基础。【方法】采用脂质体法将RPL36A基因干扰和过表达载体转染至PK15细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测RPL36A基因表达效率及细胞增殖标志基因(PCNA、Ki67、Cyclin B、CDK4)的表达变化,并通过划痕试验、CCK-8和EdU法检测细胞增殖情况。【结果】过表达RPL36A基因后,PK15细胞中PCNA、Ki67、CDK4基因mRNA表达量均极显著升高(P＜0.01),Cyclin B基因mRNA表达量显著升高(P＜0.05);PCNA蛋白表达量显著升高(P＜0.05);PK15细胞在48 h的细胞数量极显著高于空载组(P＜0.01),细胞增殖速度升高;阳性细胞数极显著升高(P＜0.01)。干扰RPL36A基因后,PK15细胞中PCNA、Cyclin B基因mRNA表达量均极显著降低(P＜0.01),Ki67、CDK4基因mRNA表达量均显著降低(P＜0.05);PCNA蛋白表达量显著降低(P＜0.05);PK15细胞在48 h的细胞数量显著低于对照组(P＜0.05),细胞增殖速度降低;阳性细胞数极显著降低(P＜0.01)。【结论】在PK15细胞中过表达和干扰RPL36A基因后,细胞增殖关键基因PCNA、Ki67、Cyclin B、CDK4的表达量及48 h的细胞数量和阳性细胞数均有显著变化,RPL36A基因可影响PK15细胞的增殖过程。

【目的】探究二酰基甘油酰基转移酶2(DGAT2)对牛前体脂肪细胞分化的影响及其对脂质代谢相关信号通路的调控作用。【方法】利用ADV1穿梭质粒构建包含目的基因的重组穿梭质粒,将重组穿梭质粒与骨架质粒pGP-Ad-Pac载体共转染293A细胞,制得过表达腺病毒载体Ad-DGAT2,用Ad-DGAT2与Ad-NC(阴性对照组)感染牛前体脂肪细胞;用油酸诱导分化96 h后,利用油红O染色观察脂滴生成情况,并检测甘油三酯(TAG)和脂联素(ADP)含量;通过实时荧光定量PCR检测脂肪生成相关基因表达情况;最后对其进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。【结果】过表达DGAT2基因可显著增加脂滴数量及TAG、ADP含量(P＜0.05),可显著上调磷酸甘油途径DGAT1、甘油磷酸酰基转移酶4(GPAT4)、酰甘油磷酸酯酰基转移酶4(AGPAT4)以及脂质代谢途径中过氧化物酶体增殖活化受体γ(PPARγ)、脂肪分化相关蛋白(PLIN2)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和硬脂酰辅酶 A 去饱和酶(SCD)的mRNA表达水平(P＜0.05)。转录组测序结果显示,与Ad-NC组相比,Ad-DGAT2感染的前体脂肪细胞中共筛选出110个差异表达基因,其中64个基因上调,46个基因下调。KEGG通路富集分析显示,差异表达基因主要富集在PPAR信号通路、甘油磷脂代谢、脂肪酸生物合成和AMPK信号通路中。【结论】过表达DGAT2基因可以促进延边牛脂肪细胞中脂滴形成、TAG积累和相关成脂基因的表达,转录组测序筛选出了与脂肪代谢相关的差异表达基因。本研究结果表明DGAT2基因在前体脂肪细胞分化过程中发挥了重要调控作用,为延边牛的分子育种提供了重要的理论依据。

【目的】在毕赤酵母中构建禽腺病毒(FAdV)血清4型和8b型串联截短Fiber2-Fiber蛋白表达系统,并探索适宜的表达条件。【方法】以前期构建的重组质粒pCold-Fiber2-Fiber为模板,用PCR法扩增Fiber2-Fiber片段,连接pPICZαA载体。经双酶切和测序鉴定后的阳性重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber电转化毕赤酵母GS115。经MD平板和不同浓度Zeocin抗性筛选后进行PCR扩增和测序鉴定得到阳性菌株;用甲醇诱导表达阳性菌株,72 h后收集蛋白上清进行SDS-PAGE和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定。采用单因素变量法对不同pH(5.0、6.0、7.0和8.0)、甲醇浓度(0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)、时间(24、48、72和96 h)进行表达条件优化,用SDS-PAGE鉴定,并用间接ELISA和Western blotting验证重组蛋白的反应原性。【结果】成功构建了重组质粒pPICZαA-Fiber2-Fiber,对表达72 h后的上清进行SDS-PAGE发现1条约70 ku的特异条带,经LC-MS/MS鉴定为目的蛋白。串联截短Fiber2-Fiber蛋白的最优诱导条件为pH 6.0、1%甲醇、诱导时间72 h。间接ELISA和Western blotting结果显示该重组蛋白能与FAdV-4和FAdV-8b阳性血清特异性结合。【结论】Fiber2-Fiber串联截短蛋白可在毕赤酵母中稳定表达并具有良好的反应原性,为禽腺病毒双价亚单位疫苗的研发奠定基础。

【目的】探讨不同比例牛角瓜和皇竹草混合青贮的品质,为调制高质量的混合青贮饲料和开发新型饲料资源提供理论依据。【方法】将牛角瓜和皇竹草按照1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶1(分别对应1C0P、2C1P、1C1P、1C2P、0C1P组)比例混合调制青贮饲料,青贮60 d后测定混合青贮饲料的感官评分、营养成分、发酵品质和强心苷含量。【结果】1C1P、1C2P和0C1P组的感官评价均优于1C0P和2C1P组,达到了优良等级;不同混合比例对混合青贮饲料中的营养成分均存在显著影响(P＜0.05);1C1P组的乳酸含量显著高于其他各组(P＜0.05),未检出丁酸;1C0P、2C1P、1C1P、1C2P组强心苷含量比青贮前分别降低了4.87%、6.59%、11.49%和9.52%。【结论】混合青贮对改善牛角瓜青贮品质具有显著效果,同时对强心苷毒素有降解作用,当牛角瓜和皇竹草比例在1∶1时青贮效果最佳。

【目的】研究水解单宁和缩合单宁对南美白对虾(Litopenaeus vannamei)生长性能、体成分、肠道消化酶活性、血清生化及抗氧化指标的影响。【方法】选取初始体重为1.04 g±0.02 g南美白对虾800尾,随机分为5组,每组4个重复,每个重复40尾虾。5个组分别为:CON(对照)、HT0.1(添加0.1%水解单宁)、HT0.2(添加0.2%水解单宁)、CT0.1(添加0.1%缩合单宁)、CT0.2(添加0.2%缩合单宁),养殖周期56 d。试验结束后统计对虾重量、数量、摄食量,计算生长性能;每缸随机选取一定数量对虾测定体成分,于围心腔采血分离血清,测定血清生化及抗氧化指标,解剖后分离肝胰腺测定肝胰腺抗氧化指标,分离肠道测定肠道消化酶活性。【结果】与CON组相比,①HT0.1组对虾终末体重(final body weight,FBW)、摄食量(feed intake,FI)、增重率(weight gain rate,WGR)和特定生长率(specific growth rate,SGR)显著提高(P＜0.05),CT0.1组对虾FI显著降低(P＜0.05),CT0.2组对虾FBW、FI、WGR和SGR均显著降低(P＜0.05);CT0.1和CT0.2组对虾肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性均显著降低(P＜0.05)。②HT0.2、CT0.1、CT0.2组对虾血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著升高(P＜0.05);HT0.1和HT0.2组对虾血清总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)显著提高(P＜0.05),HT0.1组对虾血清过氧化氢酶(catalase,CAT)活性显著提高(P＜0.05),CT0.2组对虾血清CAT活性显著降低(P＜0.05);HT0.1、HT0.2、CT0.1、CT0.2组对虾血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量均显著降低(P＜0.05)。③CT0.1组对虾肝胰腺T-AOC显著提高(P＜0.05),HT0.1、HT0.2、CT0.1、CT0.2组对虾肝胰腺超氧化物歧化酶活性均显著提高(P＜0.05),HT0.1和CT0.1组对虾肝胰腺CAT活性均显著提高(P＜0.05),HT0.2组对虾肝胰腺MDA含量显著降低(P＜0.05)。【结论】综合评价南美白对虾的生长、消化和抗氧化指标,水解单宁的应用效果优于缩合单宁,饲料中添加水解单宁的适宜剂量为0.1%。

【目的】比较两种氨基酸分析仪(百康30⁺;日立L-8900)测定饲料氨基酸含量的差异,为分析不同仪器间测定的饲料氨基酸含量的可加性提供参考。【方法】采用配对试验设计,比较两种氨基酸分析仪对能量饲料(玉米、糙米、小麦、大麦、稻谷)和蛋白质饲料(豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉、酪蛋白)氨基酸含量测定的差异,以及两种氨基酸分析仪在玉米-豆粕饲粮氨基酸含量测定上的可加性。【结果】百康30⁺测定能量饲料的7种氨基酸(赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸)含量低于日立L-8900(P＜0.05),而测定蛋白质饲料的2种氨基酸(谷氨酸、半胱氨酸)含量高于日立L-8900(P＜0.05)。但二者相对偏差均在3.0％以内。百康30⁺和日立L-8900测定能量饲料氨基酸含量的差异大于蛋白质饲料,二者能量饲料测定值的比值为94.3％~105.0％,蛋白质饲料测定值的比值为96.6％~102.4％;测定玉米-豆粕饲粮氨基酸含量的实测值分别为计算值的91.4％~107.8％和99.0％~104.3％,且前者对11种、后者对14种氨基酸含量实测值与计算值的相对偏差在4％以内。【结论】在前处理条件相同的情况下,两种氨基酸分析仪测定能量和蛋白质饲料具有满意的一致性,日立L-8900测定结果的可加性优于百康30⁺。

【目的】本试验旨在研究填饲对北京鸭生长发育、胸肌生化指标和肉品质的影响。【方法】选用120只体重相近(2 529 g±40 g)的35日龄北京鸭,随机分为2组(正常饲喂组和填饲组),每组6个重复,每重复10只鸭。试验周期为7 d,正常饲喂组1~7 d每只饲喂260 g/d,填饲组第1和2天每只分别饲喂260和300 g/d,第3~7天每只饲喂420 g/d。于试验鸭42日龄时,空腹12 h,每重复选取2只鸭,翅静脉取血5 mL后进行屠宰,对屠体、胸肌和腿肌进行称重,计算屠体率、胸肌率和腿肌率,并测定其血浆和胸肌生化指标、胸肌肉品质以及脂肪酸含量。【结果】①填饲组北京鸭平均体重、平均日增重、屠体重、屠体率和胸肌重显著高于正常饲喂组(P＜0.05),腿肌重和腿肌率显著低于正常饲喂组(P＜0.05),料重比和胸肌率在两组间无显著差异(P＞0.05)。②填饲组北京鸭血浆中的谷丙转氨酶(ALT)活力和谷丙转氨酶/谷草转氨酶(ALT/AST)显著高于正常饲喂组(P＜0.05),谷草转氨酶(AST)活力显著低于正常饲喂组(P＜0.05)。填饲组北京鸭胸肌中的水分、粗蛋白质含量和苹果酸脱氢酶(MDH)活力显著低于正常饲喂组(P＜0.05),肌内脂肪和甘油三酯(TG)含量显著高于正常饲喂组(P＜0.05)。③填饲组北京鸭胸肌亮度(L^*)、黄度(b^*)和蒸煮损失显著高于正常饲喂组(P＜0.05)。④填饲组北京鸭胸肌中C22∶5 n-6含量和多不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸(PUFA/SFA)显著低于正常饲喂组(P＜0.05),C14∶0、C16∶1 n-7、C18∶1 n-9、C20∶2 n-6、C20∶3 n-6、C22∶0、总脂肪酸(FA)、不饱和脂肪酸(UFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)含量显著高于正常饲喂组(P＜0.05)。【结论】填饲可促进北京鸭生长发育,增强北京鸭脂肪代谢,提高胸肌肌内脂肪、不饱和脂肪酸和总脂肪酸含量,降低胸肌水分和粗蛋白质含量,且填饲组北京鸭胸肌肉蒸煮损失更高。

单宁是一种天然的酚类化合物,主要表现出抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒等生物活性。然而,不同植物提取的单宁在分子组成和结构上存在显著差异,这导致不同来源单宁在生产养殖中发挥出截然不同的作用。根据其结构,单宁主要分为水解单宁和缩合单宁。缩合单宁常作为反刍家畜饲料添加剂,用于改善瘤胃能量代谢,提高饲料利用率;而水解单宁则大多作为天然的动物促生长剂,广泛应用于猪和家禽养殖中。但在实际应用时,不同浓度的单宁其作用也不尽相同。因此,在畜禽养殖中要充分利用单宁资源,需要综合考虑单宁提取物的来源、单宁的使用剂量及使用对象三方面的因素。作者对不同来源单宁的特点展开综述,诠释了来源于五倍子(Rhus chinensis Mill)、栗木(Castanea sativa Mill)、塔拉(Caesalpinia spinosa)的水解单宁改善不同家畜生长性能的潜在原因,以及来源于坚木(Schinopsis spp.)、柠条(Caragana korshinskii)的缩合单宁改变反刍动物氮代谢途径的可能机制,同时探讨了不同来源单宁的具体应用及其适用剂量,为单宁在畜禽养殖中的实际应用提供理论指导。

【目的】探讨早期断奶对五指山猪和长白猪小肠肠道免疫性能及微生物多样性的影响差异。【方法】选择生长发育及营养状况良好、28日龄断奶的长白猪与五指山猪各6头,于50日龄采集小肠各段组织、内容物、黏膜,依次采用石蜡切片(HE染色)、16S rDNA V3-V4区基因高通量测序、实时荧光定量PCR测定,比较两品种间肠道形态学、肠道菌群及肠道黏膜免疫相关基因mRNA相对表达量的差异。【结果】①五指山猪空肠绒毛高度显著低于长白猪(P＜0.05)。②长白猪十二指肠与回肠微生物多样性均较五指山猪更丰富(P＜0.05)。③在门水平上,五指山猪空肠、回肠中厚壁菌门(Firmicutes)的丰度均显著高于长白猪,但变形菌门(Proteobacteria)出现相反的表达趋势(P＜0.05)。在属水平上,五指山猪回肠中乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度显著高于长白猪(P＜0.05)。④黏膜免疫相关基因表达量的检测结果显示,长白猪十二指肠中抑炎因子白细胞介素10(IL-10)和紧密连接蛋白闭锁小带蛋白1(ZO1)的mRNA表达量均显著高于五指山猪(P＜0.05);而空肠与回肠中促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达量均显著低于五指山猪(P＜0.05)。【结论】与长白猪相比,早期断奶后五指山猪小肠肠道免疫性能及微生物多样性较差,可适当延长五指山猪的断奶日龄来减少仔猪腹泻率,以保证断奶仔猪的成活率。

【目的】研究饲粮中添加杰丁塞伯林德纳氏酵母对育成期乌苏里貉营养物质消化率、氮代谢、血清生化指标及粪便真菌菌群组成的影响。【方法】选取健康的(65±5)日龄体重相近雄性乌苏里貉45只,随机分成3组,每组15只,对照组(N组)饲喂基础饲粮,试验组分别在基础饲粮中添加低(L组)和高剂量(H组)杰丁塞伯林德纳氏酵母菌,分别为每天每只2和10 mL(1×10⁹ CFU/mL)。预试期7 d,正试期30 d。于正试期最后3 d采集粪便和饲粮样品,测定各营养物质表观消化率;试验结束当天晨饲前采集血液,晨饲后采集新鲜粪便,测定血清生化指标和粪便真菌菌群组成。【结果】与N组相比,①L组乌苏里貉粗脂肪和粗蛋白质消化率显著提高(P＜0.05),L和H组乌苏里貉氮沉积和净蛋白质利用率显著升高(P＜0.05),L组乌苏里貉粪氮排出量显著降低(P＜0.05);②L和H组乌苏里貉血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性和甘油三酯(TG)水平均显著升高(P＜0.05);③H组乌苏里貉粪便真菌Chao1和ACE指数均显著降低(P＜0.05),L和H组乌苏里貉粪便曲霉菌属(Aspergillus)和篮状菌属(Talaromyces)的相对丰度均显著降低(P＜0.05),H组乌苏里貉粪便芽枝霉属(Cladosporium)的相对丰度显著降低(P＜0.05)。【结论】饲粮中添加杰丁塞伯林德纳氏酵母可提高育成期乌苏里貉的营养物质消化率、氮代谢,降低粪便有害真菌的相对丰度,综合考虑,其适宜的添加量为每天每只2 mL(1×10⁹ CFU/mL)。

肠道菌群平衡与动物机体健康及生长发育密切相关,有机酸(organic acid,OA)作为一种绿色安全的功能性饲料添加剂,对动物具有抑菌、促消化、调节菌群平衡等作用。随着饲料产业的不断发展,OA已从饲料酸化、防腐、防霉逐渐向制剂化、动物生长促进剂和替抗产品转变,已成为畜牧行业广泛使用的一种功能性添加剂。笔者综述了猪肠道菌群的形成和分布,OA调节猪肠道菌群的组成结构和多样性及其对肠道菌群代谢产物产生和肠道免疫反应等方面的影响,并对其调控猪肠道菌群的作用机制进行探讨,旨在进一步揭示OA与肠道菌群的相互影响机制,为促进猪肠道健康与OA的合理利用提供借鉴。

绵羊作为重要的经济动物,是人类社会肉、奶和皮毛的来源之一。生长性状、胴体性状、繁殖性状、产毛性状、抗病及耐寒等都是绵羊生产和遗传育种研究领域的重要经济性状,了解这些性状的分子遗传基础,确定关键功能基因以及遗传标记位点有利于提高重要经济性状选择的准确性,进而加速绵羊经济性状的遗传改良。随着基因组重测序、转录组测序和甲基化测序等技术的发展以及全基因组关联分析技术的成熟,有关绵羊表型性状与基因型的关联分析报道较多,挖掘到一系列绵羊经济性状相关的候选基因和遗传标记。作者主要从生长发育、繁殖、尾脂沉积和羊毛生产4个角度对近几年筛选到的可用遗传标记基因进行总结,挑选出一些明星基因,如肌细胞增强因子(myocyte enhancer factor 2B,MEF2B)和生长抑素受体1(somatostatin receptor 1,SSTR1)影响绵羊体重;椎骨发育相关基因(vertebrae development associated,VRTN)是决定胸椎数量的主效基因;繁殖力基因(fecundity booroola,FecB)、骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)和卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)等与绵羊的繁殖性状相关;血小板衍生生长因子D(platelet derived growth factor D,PDGFD)和BMP2基因在肥尾羊中被强烈选择,在尾部脂肪沉积中有重要作用;Agouti信号蛋白(agouti signaling protein,ASIP)和黑皮质素1受体(melanocortin 1 receptor,MC1R)等与绵羊毛色显著相关。同时对影响绵羊经济性状的可用遗传标记基因突变位点、碱基变化及突变类型进行综述,为后续绵羊遗传育种研究提供了思路。

【目的】获取青年梅花鹿和老年梅花鹿卵巢组织的转录组信息,为深入研究梅花鹿卵巢衰老的潜在机制提供依据。【方法】以4岁龄青年梅花鹿和10岁龄老年梅花鹿卵巢作为试验样本,对样本进行石蜡切片、苏木精-伊红染色和卵泡计数;用Trizol法提取卵巢样本RNA构建转录组文库,应用Illumina HiSeq^TM2000测序平台测序,对测序结果进行差异表达基因、GO功能、KEGG通路和蛋白互作网络分析,并挑选部分差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证。通过RIPA裂解液提取卵巢样本蛋白并对组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)蛋白在青年和老年梅花鹿中的表达情况进行Western blotting检测。【结果】组织学分析结果表明,老年梅花鹿的卵巢卵泡数显著低于青年梅花鹿(P＜0.05),而闭锁卵泡数极显著高于青年梅花鹿(P＜0.01)。转录组学分析结果表明,老年和青年梅花鹿卵巢间共有1 477个差异表达基因,其中表达上调基因503个,表达下调基因974个。GO功能和KEGG通路富集结果表明,免疫系统过程、转录、DNA损伤修复、炎症反应、凋亡等生物事件与卵巢衰老有关。实时荧光定量PCR结果显示,共有17个基因在老年和青年梅花鹿卵巢中表达量差异达显著或极显著水平(P＜0.05;P＜0.01),表明RNA-Seq结果可靠。Western blotting结果表明,H3K4me3蛋白在老年和青年梅花鹿卵巢中表达量存在显著差异(P＜0.05)。【结论】青年和老年梅花鹿卵巢在卵泡数方面存在显著差异,通过RNA-Seq筛选出PI3K-Akt信号通路影响DNA损伤修复效率,参与梅花鹿卵巢衰老。H3K4me3在老年梅花鹿卵巢中高表达与转录激活有关。

母猪繁殖性能的选育增加了产仔数,但产后5 d仔猪甚至断奶前仔猪死亡率高仍然是生产中主要面对的问题。母猪母性行为的好坏对仔猪的存活、生长发育及福利都有着重要的影响,从而影响养殖效益,因此对母猪母性行为的研究具有重要意义。母猪的母性行为主要包括产前筑窝、产后哺乳、抚育和护仔等行为。母猪母性行为的实施既通过神经和激素的共同作用和调节,同时也会受到遗传、环境等多种因素的影响。随着育种目标的调整及对动物福利的重视,母猪的母性行为受到越来越多的学者关注。作者对母猪母性行为的产生机制及影响因素等进行了综述,并对未来的研究方向进行了展望,旨在为后续母猪母性行为研究提供理论基础和研究思路。

【目的】探索抗冷冻蛋白 Ⅲ(antifreeze protein Ⅲ,AFP Ⅲ)对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞线粒体的保护作用。【方法】以5~8周龄昆明雌性小鼠为试验材料,将收集的小鼠MⅡ期卵母细胞随机分为空白对照组、冷冻对照组(经过玻璃化冷冻-解冻过程)和AFP Ⅲ添加组(在冷冻平衡液及冷冻液中均添加 500 ng/mL AFP Ⅲ),利用线粒体绿色荧光探针(Mito-Tracker green,MTG)检测线粒体分布及含量,JC-1荧光染色检测线粒体膜电位,溶酶体红色荧光探针(Lyso-Tracker red,LTR)检测线粒体与溶酶体共定位,二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)检测活性氧(ROS)水平,ATP Assay Kit 检测线粒体ATP含量。【结果】与空白对照组相比,玻璃化冷冻后小鼠卵母细胞的线粒体含量显著降低,部分线粒体呈现异常的散点状分布,且线粒体-溶酶体共定位情况明显增多,线粒体膜电位显著降低(P＜0.05);同冷冻对照组相比,AFP Ⅲ添加组的小鼠卵母细胞线粒体含量显著升高,异常分布的线粒体和线粒体-溶酶体共定位情况减少,线粒体膜电位显著升高(P＜0.05)。与空白对照相比,玻璃化冷冻后小鼠卵母细胞的ROS含量显著升高而ATP含量显著降低(P＜0.05);与冷冻对照组相比,AFP Ⅲ添加组ROS含量显著下降而ATP含量显著升高(P＜0.05)。【结论】AFP Ⅲ 有助于改善玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的氧化应激反应,对冻融卵母细胞线粒体具有保护作用。

【目的】研究信号识别颗粒68(signal recognition particle 68,SRP68)基因在不同月龄湖羊不同组织中的表达情况,并分析其多态性对湖羊生长性状的影响,以期找到与绵羊生长性状显著相关的分子标记。【方法】利用实时荧光定量PCR检测SRP68基因在湖羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和背最长肌6种组织中的表达情况,以及在初生、45日龄、4月龄和6月龄时湖羊背最长肌中的表达情况;采用绵羊Illumina OvineSNP50 BeadChip对3 024只湖羊SRP68基因多态位点进行基因型检测;使用SPSS 26.0软件对SRP68基因多态位点与1 974只湖羊生长性状进行关联分析。【结果】SRP68基因在湖羊不同组织中均有表达,在45日龄和4月龄背最长肌、心脏中的表达量极显著高于其他组织(P＜0.01),在6月龄背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P＜0.01)。SRP68基因rs421715384 G＞A位点在湖羊群体中处于中度多态性(0.25＜PIC＜0.5),AA和GG基因型个体初生重和2月龄体重均显著高于GA基因型(P＜0.05),AA基因型个体5月龄体高显著高于GA和GG基因型(P＜0.05),GG基因型个体6月龄体重、管围和胸宽均显著高于AA基因型(P＜0.05)。【结论】SRP68基因与湖羊肌肉发育密切相关,rs421715384 G＞A位点可作为湖羊生长性状的潜在分子标记,为湖羊分子育种提供参考。

【目的】探究猪特有的细胞色素P450超家族3A亚族成员29(cytochrome P450 3A 29,CYP3A29)基因3'-UTR区核苷酸结构变异(structural variation,SV)对该基因表达的影响,解析该结构变异与香猪肉质性状形成的关系。【方法】以香猪、大白猪为研究对象,应用UCSC、miRBase、PITA、RBPsuite等软件预测CYP3A29基因3'-UTR区结构变异区间所包含的重复元件、miRNA和RBP结合位点;采用PCR方法对结构变异位点进行基因分型;计算群体基因型频率、基因频率及Hardy-Weinberg平衡状态;采用实时荧光定量PCR检测该变异对CYP3A29基因表达的影响;利用ELISA法检测香猪肌肉组织中CYP3A29蛋白含量和雄激素(T、DHT)水平,并使用SPSS 17.0软件对T、DHT含量与不同基因型进行Pearson相关性分析。【结果】生物信息学分析显示,CYP3A29基因3'-UTR的结构变异区全长303 bp,该变异区存在1个长为241 bp的短散在元件(short interspersed element,SINE),属于Pre0_SStRNA家族,位于Chr3:6 819 917―6 820 161,含有33个miRNAs和13个RBPs结合位点。基因分型显示,该结构变异在香猪、大白猪群体中呈现出丰富的多态性,表现为II基因型(插入型)、ID基因型(杂合型)、DD基因型(双缺失)。基因型群体分布频率显示,香猪中的D等位基因频率高于大白猪,该结构变异在香猪中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),在大白猪中处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P＜0.05)。实时荧光定量PCR和ELISA结果显示,CYP3A29基因ID基因型个体mRNA表达量和蛋白含量均显著高于II和DD基因型(P＜0.05)。相关性分析结果显示,香猪不同基因型个体CYP3A29基因含量与肌肉组织中T浓度呈显著相关(P＜0.05),与DHT浓度不相关(P＞0.05)。香猪ID基因型个体T浓度显著高于DD和II基因型(P＜0.05),DD基因型个体DHT浓度显著高于ID和II基因型(P＜0.05)。【结论】CYP3A29基因3'-UTR区长度为303 bp的结构变异在香猪群体中具有多态性,以缺失型D等位基因为主,即该结构变异在香猪中缺失SINE元件,导致CYP3A29基因表达上调,进而影响香猪肌肉组织中T浓度。CYP3A29基因3'-UTR结构变异与香猪肉质性状具有相关性。

【目的】揭示双峰驼泌乳期产奶性状、规律及影响因素,分析高、低产双峰驼差异性生长性状及血液和驼乳生理生化指标,为高产驼选育提供基础研究资料。【方法】以准噶尔泌乳双峰驼为研究对象,对产奶量进行监测,绘制哺乳期泌乳曲线,并分析不同胎次的产奶量。测定高、低产双峰驼体尺、体重、血液及驼乳理化指标并进行差异性及相关性分析。【结果】双峰驼挤奶期约10个泌乳月,前3个泌乳月产奶量高,第4~7个泌乳月产奶量呈持续下降,第7~9个泌乳月产奶量略有回升,第10个泌乳月产奶量达到最低,可归纳为4种类型的泌乳曲线。产奶量的高峰期一般在2~6胎,最佳年龄为6~15岁。高产驼组的产奶量极显著高于低产驼组(P＜0.01);高产驼组的体重、血尿素氮及血尿素均显著高于低产驼组(P＜0.05),而高产驼组血清白蛋白及血清钙含量显著低于低产驼组(P＜0.05);高产驼组驼乳的乳脂、乳蛋白显著低于低产驼组(P＜0.01);相关性分析结果显示,血液理化指标与产奶性状具有较强的相关性。【结论】双峰驼产奶性能受到机体、泌乳阶段、营养环境等多因素影响,体重、血液及乳成分与产奶量具有一定相关性。结果为进一步提高双峰驼产奶性能及高产驼选育提供理论数据。

ADP核糖基转移酶3(ADP-ribosyl transferases 3,ART3)是ADP核糖基转移酶(ADP-ribosyl transferases,ARTs)家族成员之一,与非阻塞性无精症及癌症高度相关,干扰ART3基因或抑制该基因编码蛋白的表达,会导致精子密度降低、畸形率升高和曲细精管生精细胞脱落。ART3在精子发生过程中不可或缺,因此,深入研究其功能很有必要。目前,ART3在精子发生中的具体作用机制尚不清楚,并且相关研究报道较少。笔者综述了ARTs家族成员蛋白结构及其在精子发生中的作用,ART3蛋白结构预测及其在睾丸组织中的定位,并通过分析其在三阴性乳腺癌和黑色素瘤中的功能和作用,探讨其可能参与的调控通路,以期为揭示ART3在精子发生中的功能及作用机制提供科学参考,为提升动物精液品质、解决雄性不育等问题提供思路。

【目的】以产单、双胎蒙古羊为动物模型初步探究双羔主效基因含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS-1)的作用机制,为蒙古羊高效繁育及其相关研究提供理论依据。【方法】选取具有产单、双胎记录的雌性蒙古羊各12只,采用自然发情方式,通过阴道黏膜涂片和公羊爬跨确定雌性蒙古羊的发情期和间情期,分别取产双羔发情期(DE)、产双羔间情期(DD)、产单羔发情期(SE)、产单羔间情期(SD)蒙古羊卵巢,利用HE染色的方式观察卵巢有腔卵泡形态差异。取蒙古羊卵巢颗粒细胞进行培养,运用免疫荧光技术确定ADAMTS-1表达位置。通过实时荧光定量PCR技术检测ADAMTS-1、孕酮受体(PGR)、丝裂原活蛋白激酶4(MAPK4)、雄激素受体 (AR)、丝氨酸蛋白酶抑制剂2(SERPINE2)、多功能蛋白聚糖蛋白聚糖(Versican)在不同组别中的mRNA相对表达水平,并通过Western blotting技术检测ADAMTS-1前体蛋白(pro-ADAMTS-1)和成熟蛋白(MP-ADAMTS-1)在不同组别中的蛋白相对表达水平。【结果】通过HE染色结果可以确定产单、双胎蒙古羊卵巢组织内有腔卵泡形态无表观差异,运用免疫荧光方法检测到ADAMTS-1在蒙古羊卵巢颗粒细胞上表达。通过荧光定量PCR及Western blotting结果可知,DE组蒙古羊中ADAMTS-1在卵巢组织中基因及蛋白表达量显著高于其他3组(P＜0.05),而在SE与SD组无显著差异(P＞0.05);SE组蒙古羊卵巢组织内AR和PGR基因表达量最高,且显著高于其他3组(P＜0.05),DE组显著高于DD组(P＜0.05),且在同一发情阶段产单羔蒙古羊卵巢组织内AR、PGR基因表达量显著高于产双羔蒙古羊卵巢组织;SE组蒙古羊卵巢内MAPK4基因表达量最高,且显著高于其他3组(P＜0.05),其他3组间无显著差异(P＞0.05);DD组蒙古羊卵巢组织内Versican、SERPINE2基因表达量最高,且显著高于DE和SD组(P＜0.05);SE组这两个因子显著高于SD组(P＜0.05)。【结论】ADAMTS-1于蒙古羊卵巢颗粒细胞中稳定表达,ADAMTS-1对蒙古羊双羔性状的排卵机制具有重要的正向调控作用,而其他多种激素受体以及胞内关键信号基因也与卵巢内卵泡的发育、排出密切相关。

【目的】探究抗缪勒氏管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)抑制山麻鸭卵泡发育的分子调控机制。【方法】选取40只29周龄产蛋山麻鸭,随机分为4组:AMH1、AMH2、AMH3和对照组,AMH1、AMH2和AMH3组给予2、20和200 μg/d AMH多肽;对照组给予同等体积的生理盐水,整个试验持续21 d;每天记录产蛋量,在试验末采集卵巢和卵泡进行计数,称重计算卵巢指数,测定血清促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、孕酮(progesterone,P₄)和雌二醇(estradiol,E₂)水平,检测等级卵泡(F6)、小黄卵泡(SYF)和大白卵泡(LWF)中卵泡刺激素受体(FSHR)、促黄体生成素受体(LHR)、类固醇生成急性调节蛋白(StAR)、3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)、雌激素合成酶(CYP19A1)、生长分化因子9(GDF9)、骨形态发生蛋白15(BMP15)基因表达量,以及F6和SYF中StAR、GDF9蛋白表达水平。【结果】与对照组相比,AMH2和AMH3组的产蛋率显著下降(P＜0.05),其中AMH3组对产蛋率的抑制作用最为明显;AMH1和AMH2组SYF和LWF数量显著上升(P＜0.05),而卵巢指数和LYF数量没有明显变化,血清LH、P₄和E₂水平呈剂量依赖性下降,AMH3组对生殖激素抑制作用较明显,其中AMH3组LH水平显著下降(P＜0.05)。与对照组相比,在F6中,AMH2组GDF9基因和AMH1组BMP15基因表达水平显著上升(P＜0.05);在SYF中,除AMH2组GDF9基因外,各试验组FSHR基因表达水平显著下降,GDF9和BMP15基因表达水平显著上升(P＜0.05),AMH3组GDF9蛋白水平显著上升(P＜0.05);在LWF中AMH2和AMH3组的GDF9和BMP15基因表达水平显著上升(P＜0.05)。给予外源性AMH对F6和LWF中CYP19A1、3β-HSD和StAR基因表达水平均无显著影响(P＞0.05),在SYF中,AMH1、AMH2和AMH3组中CYP19A1、3β-HSD和StAR基因表达水平均显著低于对照组(除AMH2组的CYP19A1基因外,P＜0.05);与对照组相比,给予外源性AMH对F6和SYF中StAR的蛋白水平均无显著影响(P＞0.05)。【结论】200 μg/d外源性AMH可显著抑制卵泡发育,主要通过抑制LH、P₄和E₂的分泌,上调卵泡中GDF9和BMP15表达水平,下调FSHR和LHR以及影响类固醇激素合成通路关键因子的表达来影响卵泡发育。

【目的】探究怀化地区犬瘟热病毒的基因变异与遗传多样性情况,阐明其遗传进化关系。【方法】从怀化地区收集30株犬源犬瘟热病毒样本,用PCR法扩增其H、F基因序列。利用DNAStar软件分析H、F基因序列碱基组成;利用Clustal X、MegAlign软件进行变异位点和遗传多样性分析;运用Clustal X、PhyML 3.0软件,采用最大似然法(ML)对怀化地区犬瘟热病毒进行遗传进化分析,并用FigTree v 1.3.1软件构建遗传进化树。【结果】30株怀化地区犬瘟热病毒均为Asia-Ⅰ型,其H、F基因序列长度分别为1 778和1 850 bp,其AT含量分别为56.8%~57.9%和54.9%~56.1%,GC含量分别为42.2%~43.0%和44.1%~44.9%。H基因的种内差异为0~3.1%,种间差异为51.36%~60.15%;F基因的种内差异为0~2.4%,种间差异为39.60%~53.09%。基于H、F基因序列所构建的遗传进化树发现,来源于怀化地区的30株犬源犬瘟热病毒全部位于遗传进化树的同一分支上。【结论】来源于怀化地区犬瘟热病毒之间虽存在一定程度的基因变异和遗传多样性,但它们之间的亲缘关系较近。且其H、F基因序列的种内差异小、种间差异大,是研究犬瘟热病毒基因变异、遗传多样性和遗传进化的重要遗传标记。

连续性纯合片段(runs of homozygosity,ROH)是基因组中的一段长纯合片段,不同长度的ROH和个体与共同祖先的亲缘背景相关联,亲缘关系越远ROH片段越短。在近交过程中,随着世代数的增加,子代个体从共同祖先遗传得到的ROH会被不断地打断重排。在整个遗传信息传递过程中,可以根据ROH的长短来判断个体间亲缘关系的亲近程度。ROH受种群近交、种群瓶颈、基因组特征、人工选择等多种因素的制约,这些制约因素会在其基因组上留下各种印记。ROH中有丰富的遗传信息,促使ROH成为研究绵羊基因组信息的新手段。近年来,随着高通量测序技术的发展,研究人员利用基因组ROH来评估近交程度和遗传多样性、推断种群结构和种群历史、筛选和鉴定重要经济性状功能基因,进行个体选择并追踪选择信号。因此,笔者就ROH产生原理、影响因素、检测方法及其在绵羊遗传育种中的应用等方面进行综述,以期能准确制定绵羊种质资源保护策略,为ROH在绵羊遗传育种中的应用提供理论依据。

【目的】探究奶牛乳房炎风险评估体系在中国南北方奶牛场近年来实际应用的准确性和稳定性,观察该体系是否可以稳定应用于中国荷斯坦牛群奶牛乳房炎的预测。【方法】基于课题组已构建的奶牛乳房炎Logistic回归模型(cow mastitis logistic regression model,CMLM),在北京、河南、浙江6个荷斯坦牛场进行大规模横向、纵向数据验证,以北方地区5个荷斯坦牛场(覆盖北京、河南)以及南方地区1个荷斯坦牛场(浙江)共56 985头次泌乳牛的奶牛群体改良(dairy herd improvement,DHI)信息作为验证数据,验证奶牛乳房炎风险评估体系的预测能力;利用北方地区2016―2021年27万余条DHI测定记录,检验CMLM在整体不同时间段下的大规模纵向数据验证效果。【结果】CMLM在北京地区荷斯坦牛群的验证数据集中,平均准确率为71.85%,表现较优且稳定;在新加入的河南大群奶牛场的验证数据集中也有较好的实际应用表现,平均准确率为78.67%。CMLM在中国南方小群奶牛场长达180个月的验证数据集中应用表现稳定,平均准确率为77.63%。CMLM在不同时间阶段均具有较高的预测效力,模型的预测价值集中在0.70~0.90之间,可以认为该模型良好。【结论】CMLM体系在中国南北方荷斯坦牛群中应用表现优异,在大规模横向、纵向数据的验证中也有较高的预测效力,具有较高推广应用价值。

【目的】确定四川省甘孜藏族自治州发病藏猪的病原菌,探究各菌株之间的亲缘关系及耐药性,为对其进行有效防控提供科学依据。【方法】从病死猪肺脏中分离出1株可疑病原菌,通过细菌分离培养、16S rRNA PCR扩增测序、遗传演化分析、药敏试验、耐药基因与23S rRNA突变位点检测、生物被膜试验、小鼠致病试验对分离菌株进行鉴定和分析。【结果】经16S rRNA PCR扩增与遗传进化分析显示,该菌与西班牙菌株CR-18、LG6-7g、AR-5A、GM5-1的核苷酸序列相似性均为100%,并与猪源莫拉菌聚为一个遗传分支,表明该病原菌为Moraxella pluranimalium,命名为KD-4。形态学观察显示该菌为双肾型革兰阴性双球菌。生物被膜试验测定显示,该菌可形成生物被膜,使动物病变痊愈后仍有细菌定植在体内,长期成为该病原菌的宿主。药敏试验结果显示,该菌对抗菌药物复达欣、磺胺异噁唑高度敏感;对盐酸大观霉素、美罗培南中度敏感;对氨苄青霉素、庆大霉素、阿莫西林、头孢噻呋钠、氟苯尼考、四环素、恩诺沙星耐药。其中,复达欣、磺胺异噁唑、盐酸大观霉素和美罗培南对该菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为2、128、64和2 μg/mL。耐药基因检测结果显示,ermF、ermB、tetB、tetD、bla_TEM、bla_CTX-M基因均未检出。23S rRNA序列分析显示,存在A2982T、C3132T等15个突变位点,推测与分离菌株出现多重耐药有关。小鼠致病性试验结果显示,该菌可引起小鼠肺脏出现少量出血点,脾脏明显肿大,但不致死,耐过后可恢复健康。【结论】本研究为国内首次报道藏猪源Moraxella pluranimalium,药敏试验结果可为该菌引起的疾病防治与流行病学调查提供参考依据。

犬细小病毒病危害犬的健康,传统疫苗不能有效保护犬免受病毒的侵扰,寻求新的疫苗是当前研究和关注的热点。VP2蛋白是犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的主要保护性抗原蛋白,在决定宿主范围和入侵过程中起重要作用。此外,VP2蛋白在N-端结构域和环结构域中含有几个重要的B细胞表位,可在CPV感染过程中诱导产生有效的中和抗体。因此,在开发CPV基因组亚单位疫苗中,VP2蛋白可作为候选抗原的首选。病毒样颗粒(VLPs)与天然病毒相似,但不具备天然病毒的复制功能引起机体发生感染,故近几年来利用不同的表达系统组装VP2蛋白一直是研究者们研究的重点。笔者着重对CPV VP2蛋白的特点及构象进行分析,通过特点分析得知CPV衣壳的主要成分中含有VP2,不但具有血凝活性,还与CPV的宿主范围和抗原性密切相关,因此,有活性的VP2蛋白在CPV基因工程亚单位疫苗的开发中极其重要。通过构象分析得知CPV VP2 蛋白环状结构(Flexible loop)具有更大的灵活性,这可能是 CPV 感染宿主范围不断扩大的分子基础。同时笔者对VLPs疫苗的制备方法及优缺点进行讨论,以期为CPV疫苗的研究制备提供有利的参考和科学依据。

【目的】了解杭州地区宠物衣原体的流行情况。【方法】采用PCR和间接血凝试验(IHA)对杭州某动物医院238份宠物犬眼结膜拭子、556份宠物猫眼结膜拭子、98份宠物鸟血清样本和花鸟市场264份鹦鹉血清样本进行衣原体检测,并对阳性样本进行核苷酸序列测定。利用SPSS 25.0软件分析动物的年龄、性别对衣原体感染有无统计学意义;利用Clustal W和Mega 11.0软件将流行株的主要毒力基因与已发表的参考序列进行相似性比对、进化关系分析。【结果】与宠物猫相比,动物医院中宠物犬和鸟不易感染衣原体,宠物猫检测出阳性样本13份,阳性率为2.34%。幼猫(＜1岁)的感染率(3.57%)最高,公猫的感染率(2.70%)略高于母猫(2.02%),差异均不显著(P＞0.05)。13份猫阳性样本测序分析显示,均为猫衣原体(Chlamydia felis),与猫衣原体Fe/C-56 ompA基因相似性在99.2%~99.7%之间。花鸟市场鹦鹉检测出阳性样本14份,阳性率为5.30%。受感染的鹦鹉中幼鸟(＜1岁)的感染率(9.78%)最高,雌鸟感染率(6.25%)高于雄鸟(4.41%),差异均不显著(P＞0.05)。花鸟市场的鹦鹉感染率(5.30%)高于动物医院的鸟(0),14份鹦鹉阳性样本测序分析显示,均为鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci),与鹦鹉热衣原体6BC ompA基因相似性在99.4%~99.5%之间。【结论】本研究首次对杭州地区宠物衣原体流行情况进行调查,结果表明杭州市宠物猫和花鸟市场鹦鹉存在衣原体的感染,给人类健康带来了潜在威胁,因此,应当提高对宠物衣原体感染的重视,采取适当的饲养管理措施防控衣原体感染,避免人兽共患。

【目的】本研究以猪种布鲁氏菌Toll/白介素-1受体(TIR)结构域蛋白(Brucella suis TIR domain containing protein,Bs-TDCP)为研究对象,进行基因克隆、生物信息学分析及蛋白互作研究,为后续开发适合动物或人类使用的有效布鲁氏菌疫苗奠定基础。【方法】利用GenBank数据库查找黑腹果蝇髓样分化因子88(Dm-MyD88)和人MyD88(Hs-MyD88)基因序列,设计特异性引物进行基因序列扩增。根据猪种布鲁氏菌测序结果,获得Bs-TDCP基因序列。通过ExPASy、SWISS-MODEL、TMHMM、SMART等在线工具分析Bs-TDCP蛋白理化性质、二级和三级结构、跨膜及功能结构域,并进一步研究Bs-TDCP蛋白与Toll样受体(TLRs)信号通路的关键胞内配体MyD88分子之间的蛋白串扰。【结果】猪种布鲁氏菌TIR结构域蛋白Bs-TDCP基因的开放阅读框(ORF)大小为828 bp,编码275个氨基酸,其中丙氨酸占12.7%,分子式为C₁₃₄₅H₂₁₉₆N₃₉₀O₄₂₄S₆,Bs-TDCP蛋白分子质量为35.85 ku,理论等电点为9.37,不稳定指数为50.44,属于不稳定疏水性蛋白,不包含跨膜结构域和信号肽序列(SPS),但其具有典型的TIR结构域,Bs-TDCP蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,占比分别为77.45%、8.36%、2.91%和11.27%。重组蛋白Bs-TDCP(rBs-TDCP)、重组蛋白Dm-MyD88 (rDm-MyD88)和重组蛋白Hs-MyD88(rHs-MyD88)亲和纯化效果良好。蛋白体外结合试验结果表明,不含His标签的Bs-TDCP(rBs-TDCP^△)与MyD88分子之间存在蛋白互作。【结论】rBs-TDCP^△分别与rDm-MyD88、rHs-MyD88配体存在一定程度的蛋白互作,本研究结果为开发供人类使用的新型布鲁氏菌疫苗提供理论参考。

草食动物的抗病育种研究正由传统育种转向分子水平,其免疫系统中的抗体具有十分独特的结构和多样性产生机制,丰富的抗体库是草食动物抗病力形成的重要基础。抗体由免疫球蛋白构成,免疫球蛋白具有重链和轻链,并且各个草食动物的免疫球蛋白结构和多样性机制存在一定差异。虽然草食动物免疫球蛋白基因数量有限,但是多种形式的多样性机制促成了其丰富抗体库的形成,进一步增强了动物的免疫能力。目前草食动物在养殖场中的病死率较高,其免疫水平的提升迫在眉睫,因此对其免疫球蛋白结构和多样性机制的研究十分重要。作者介绍了免疫球蛋白的基本结构和几种不同的类型,并简述了牛、羊、兔、骆驼这4种草食动物免疫球蛋白的基因结构及其表达多样性机制,旨在为其抗病育种研究提供相关的理论依据和研究思路。

【目的】建立检测鸡肠道黏膜柔嫩艾美耳球虫SIgA抗体的间接ELISA检测方法以期对鸡柔嫩艾美耳球虫特异性黏膜免疫水平进行评价。【方法】将鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2和SO7基因克隆至pET-28a(+)原核表达载体,构建EtMIC2-SO7重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。采用镍柱亲和层析法对EtMIC2-SO7重组蛋白进行纯化,用Bradford法测定蛋白浓度。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定法,确定ELISA检测抗原、待检黏膜的最佳工作浓度,通过单一变量法确定最佳待检黏膜孵育时间、封闭液种类、酶标二抗、显色液工作条件,参照ELISA抗体检测试剂盒阴阳性判定标准,以S/P≥0.4 为阳性,S/P＜0.4为阴性作为黏膜样品阴阳性判定标准,对ELISA检测方法的重复性、特异性、敏感性进行验证并与鸡柔嫩艾美耳球虫全蛋白包被ELISA板检测结果进行符合率比较。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果显示,获得大小约70 ku的EtMIC2-SO7重组蛋白,与预期结果相符。ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为2 μg/mL,待检黏膜最适稀释度为1∶40,待检黏膜最适孵育时间为2 h,最适封闭液为5%脱脂奶粉,最适酶标二抗稀释度为1∶100 000,最适反应时间为1 h,最适显色时间为15 min;批内、批间重复性试验变异系数均＜10%;与新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒特异性SIgA抗体无交叉反应性;随机选择2份阳性肠道黏膜样品进行敏感性试验,稀释浓度为1∶80时2份样品仍判定为阳性,说明该检测方法敏感性较好;将EtMIC2-SO7重组蛋白和鸡柔嫩艾美耳球虫全蛋白分别包被ELISA板,检测18份肠道黏膜样品,结果表明EtMIC2-SO7重组蛋白包被ELISA板与球虫全蛋白包被ELISA板符合率可达88.9%(16/18)。【结论】本研究采用原核表达系统成功表达并纯化EtMIC2-SO7重组蛋白,并将其作为ELISA包被抗原,成功建立重复性好、特异性强、敏感性高的鸡柔嫩艾美耳球虫SIgA抗体的间接ELISA检测方法,为球虫黏膜免疫疫苗评价提供了初步检测方法。

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3 895和1 752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性＞99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带;IFA观察结果显示,感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光,表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白,且该蛋白具有良好的抗原性;病毒滴度测定结果显示,初代重组腺病毒的TCID₅₀为10^5.5/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP60基因的重组腺病毒,并成功表达了RHDV2 VP60蛋白,为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。

【目的】了解拥有养殖-屠宰-运输-销售环节的现代化农牧食品企业鸡肉生产链各环节中沙门氏菌耐药情况及分子分型特征。【方法】本研究对在2020年10月—2021年09月从苏北某农牧食品企业下属的养殖场、屠宰厂、运输车辆、专营店分季度连续采集样品中分离得到的37株沙门氏菌,采用纸片扩散法进行13种常用抗菌药物敏感试验,PCR进行11种耐药基因检测、脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型检测。【结果】37株沙门氏菌均耐药,对氨苄西林耐药率最高,为67.57%,对多西环素、庆大霉素、四环素耐药率超过50%,对头孢西丁耐药率最低,为8.11%,各环节沙门氏菌分离菌株对氨苄西林的耐药率均超过50%,沿该鸡肉生产链氨苄西林耐药率呈现下降趋势,耐药率同样呈现下降趋势的抗菌药有头孢他啶、头孢曲松、环丙沙星、四环素,耐药率呈现上升趋势的抗菌药有头孢西丁、甲氧苄氨嘧啶、庆大霉素、丁胺卡那霉素;耐3种及以上抗菌药的菌株为34株,多重耐药率为94.59%,养殖环节、运输环节和销售环节沙门氏菌分离株的多重耐药率均为100%;养殖环节沙门氏菌分离株耐药物种类数最多集中在耐7种及以上抗菌药,对8种抗菌药的耐药率高于其他环节;耐药基因中bla_PSE的检出率最高,为56.76%,未检测到tetC耐药基因;PFGE分型共有26种不同的PFGE带型产生,相似度100%的带型有7组。【结论】苏北某农牧食品企业鸡肉生产链中沙门氏菌有较高的耐药性,多重耐药严重,养殖环节耐药性高于其他环节,PFGE分型提示耐药菌株能够沿生产链"养殖-屠宰"的途径传播,且长期存在,养殖环节避免耐药沙门菌的产生是保障鸡肉产品安全生产关键点。

水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AMD)是由水貂阿留申病病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)引起的水貂的重要传染性疾病之一,深入开展对AMDV的研究对于该病的防控有重要意义。AMDV基因组全长约为4.8 kb,主要编码2种结构蛋白和3种非结构蛋白,它们在病毒复制、增殖及致病过程中发挥重要作用。AMDV的复制依赖于代谢活跃的细胞,对于幼貂,病毒感染肺泡Ⅱ型细胞会造成急性致死性肺炎,感染巨噬细胞则会引起成年水貂患高丙种球蛋白血症和免疫复合物介导的肾小球肾炎等慢性进行性疾病。笔者从AMDV侵入细胞的受体途径、诱导细胞凋亡途径及病毒复制等方面对其致病机理进行阐述。AMDV在全世界范围内广泛流行,现有的检测方法主要分为血清学诊断方法和分子生物学诊断方法。目前,尚未开发出安全有效的针对AMDV的商品化疫苗,随着生物学技术的快速发展,在灭活疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗的研制上有所进展;抗病毒的新方法,如筛选AMDV耐受貂,提高水貂免疫力和靶向适配体技术为AMD的防控提供了新思路。文章从AMDV编码蛋白功能、病毒细胞嗜性与复制、临床表现与致病机制、诊断方法及防治措施等方面对近年来国内外AMDV的研究进展进行总结,旨在为AMDV安全有效疫苗和防治药物的研发提供参考。

【目的】调查河南省猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒流行特征及遗传变异情况。【方法】用ELISA法检测2020—2021年从河南省766个不同养殖规模猪场采集的25 411份血清样本的gE抗体水平;采用PCR法对从47个猪场疑似PRV感染猪群中收集的251份病料进行gE基因扩增,并将阳性病料样品接种ST细胞进行病毒分离、gE全基因测序和遗传进化分析。【结果】血清样品gE抗体总阳性率为18.42%,从2020年的20.32%降至2021年的16.69%,猪场阳性率为50.26%。随着猪场规模增大,猪场阳性率、血清样本阳性率呈下降趋势;商品代养殖场、屠宰场和种猪场的场阳性率、血清样本阳性率依次降低;豫东、豫西、豫南、豫北和豫中血清gE抗体阳性率分别为15.05%、23.48%、16.50%、16.69%和20.10%,1-3月阳性率最高,10-12月最低。组织病料样品中PRV阳性率为15.14%(38/251),从PRV阳性病料样品中共分离出9株PRV分离株。gE全基因序列遗传进化分析结果显示,分离株都属于GenotypeⅡ型,且猪群中既有PRV经典株也有PRV变异株。【结论】河南省猪场中仍然存在PRV感染,且同时存在PRV经典株和PRV变异株,本研究结果为河南省猪伪狂犬病的防控与净化提供参考依据。

【目的】基于缺氧-炎症-内皮增殖理论,探讨腹水综合征肉鸡肺组织的发病机理,并研究复方中药的防治机制。【方法】选取150羽8日龄健康AA肉鸡,随机分为5组,空白对照组常规饲养;肉鸡腹水综合征模型组采用低温、高能饲料、高钠饮水多因素法造模;在模型组基础上,高、中、低剂量复方中药组于每日饮水中按体重分别添加2.0、1.0、0.5 g/kg复方中药。观察临床症状和剖检变化;采用全自动血细胞分析仪检测血液白细胞计数;利用实时荧光定量PCR检测肺组织中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM1)、Sprouty相关EVH1域含蛋白质1(Sprouty-related,EVH1 domain-containing protein 1,SPRED1)、磷脂酰肌醇-3激酶调节亚单位2(phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit 2,PIK3R2)基因及miRNA-126-3p的表达量;采用ELISA法检测肺组织中VCAM1、SPRED1、PIK3R2蛋白表达量。【结果】与空白对照组相比,模型组肉鸡精神萎靡,腹部膨大,剖检可见腹腔内有大量腹水,肺脏、肝脏肿大充血,有心包积液;25、35、45、55日龄模型组肉鸡血液中白细胞计数极显著升高(P＜0.01);35日龄模型组肉鸡肺组织中HIF-1α基因表达量极显著升高(P＜0.01);15、25、35、45日龄模型组肉鸡肺组织中VCAM1基因和蛋白表达量均极显著升高(P＜0.01);15日龄模型组肉鸡肺组织中SPRED1基因和PIK3R2蛋白表达量均极显著降低(P＜0.01);25、35、45日龄模型组肉鸡肺组织中SPRED1、PIK3R2基因和蛋白表达量均极显著降低(P＜0.01);35日龄模型组肉鸡肺组织中miRNA-126-3p相对表达量极显著升高(P＜0.01)。与模型组相比,复方中药各剂量组肉鸡上述结果均有不同程度改善,其中复方中药高剂量组各指标变化最为明显。【结论】肺组织缺氧可引发炎症及增殖异常,参与了肉鸡腹水综合征的发生发展;复方中药可有效防治肉鸡腹水综合征,且2.0 g/mL复方中药作用效果最好,其作用机制与调节肺组织缺氧、炎症、增殖密切相关。

在小鼠、猪、牛、羊、人等哺乳动物肠道中含有大量微生物,这些微生物对肠道稳态和宿主健康至关重要。肠道微生物紊乱会导致肠道炎症、神经系统疾病、功能代谢障碍等多种疾病,从而对动物及人类健康造成严重危害。在不同物种及不同品种间都会表现出各自独特的肠道微生物特征,这些微生物的稳态平衡对动物的健康非常重要。现阶段研究发现,粪菌微生物移植(fecal microbiota transplantation,FMT)在恢复肠道微生物失调、干预或重建哺乳动物肠道微生物菌群平衡中发挥着重要作用,FMT这一治疗手段也逐渐在感染性疾病和非感染性疾病中得到广泛应用。随着FMT技术的发展,在哺乳动物中通过调控微生物治疗肠道疾病或其他疾病的研究都有了新的方向,而这一技术手段也逐渐广泛应用于各个研究领域。本综述基于FMT在现有研究领域中的应用,总结了其被广泛应用于肠道及与肠道相关疾病中的研究进展,旨在为建立更规范、高效、安全、有益的哺乳动物FMT体系,以及FMT在提高哺乳动物生产性能、养殖、疾病防治等方面提供新参考、新思路。

【目的】分析预测金银花缓解牛氧化应激的潜在活性成分和靶点,探讨其可能的作用机理。【方法】利用中药系统药理学分析平台(TCMSP)和文献查找的方式搜集金银花的活性成分,使用TCMSP和SwissTargetPrediction数据库查找活性成分对应的靶点,在NCBI数据库的Gene平台收集牛氧化应激相关基因。使用STRING数据库和Cytoscape 3.8.2软件构建并分析金银花与牛氧化应激蛋白-蛋白相互作用网络。利用DAVID数据库对交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。通过AutoDock软件进行分子对接验证关键活性成分与核心靶点的结合活性。【结果】共获得37个金银花有效活性成分,涉及37个与牛氧化应激相关的靶点。其中槲皮素、山柰酚、木犀草素、芦丁、金圣草黄素等为金银花缓解牛氧化应激的关键活性成分,肿瘤坏死因子(TNF)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、β-连环蛋白(CTNNB1)、血清白蛋白(ALB)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(CASP3)、过氧化氢酶(CAT)、肿瘤蛋白p53(TP53)等为金银花缓解牛氧化应激的核心靶点。GO功能和KEGG通路富集分析显示,靶点的作用涉及生物过程、细胞组分和分子功能3个方面,并参与到缺氧诱导因子1信号通路、过氧物酶体、MAPK信号通路等多条代谢通路。分子对接结果验证了金银花的关键活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素与核心靶点TNF、PTGS2、CTNNB1、ALB、CASP3、CAT、TP53均有较好的结合活性。【结论】本研究结果揭示了金银花缓解牛氧化应激的潜在活性成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素等,作用靶点为TNF、PTGS2、CTNNB1等,为金银花作为功能性饲料添加剂的开发和后续研究提供理论参考。

【目的】建立一种绵羊组织中地昔尼尔及其代谢产物2,4,6-三氨基-5-氰基嘧啶质量浓度的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法。【方法】对采集的绵羊肌肉、脂肪、肝脏、肾脏组织进行前处理,以乙腈和七氟丁酸水溶液为流动相,利用Acquity UPLC Beh C18色谱柱进行梯度洗脱;流速为0.15 mL/min,柱温为30 ℃,进样量为5 μL。在正离子扫描模式下通过多离子反应监测采集数据,采用外标法测定地昔尼尔及其代谢产物浓度,并考察该检测方法的线性范围、检测限、定量限、回收率、批内与批间精密度、准确度和稳定性。【结果】建立的检测方法灵敏度高,检测限为10 μg/kg,定量限为20 μg/kg,地昔尼尔和2,4,6-三氨基-5-氰基嘧啶的添加浓度为20~1 000 μg/kg,标准曲线的线性关系良好,相关系数均≥0.99。将地昔尼尔和2,4,6-三氨基-5-氰基嘧啶以高、中、低、定量限4个水平分别添加到各空白组织中,测得地昔尼尔和2,4,6-三氨基-5-氰基嘧啶的回收率为70%~110%,批内和批间变异系数均<15%。在考察的条件下,地昔尼尔和2,4,6-三氨基-5-氰基嘧在各组织中的稳定性良好。【结论】建立的UPLC-MS/MS检测方法专属性强、重复性好、灵敏度高,可适用于地昔尼尔乳剂在绵羊组织内的药物代谢动力学和残留研究。

【目的】筛选和分析环状RNA(circRNA)在犬乳腺肿瘤(CMGT)耐药中的作用,为肿瘤诊断和治疗提供新靶点。【方法】以CMGT细胞CHMm作为研究对象,首先通过浓度梯度法和浓度维持法构建CMGT他莫昔芬(TAM)耐药细胞系,然后采用CCK-8法检测CMGT细胞对TAM的敏感性,最后通过高通量测序技术筛选耐药细胞中差异表达的circRNAs,通过GO功能和KEGG信号通路分析其可能参与的生物过程。【结果】经过TAM持续刺激,CHMm形态变为长梭形,半数抑制浓度(IC₅₀)由4.07提高至13.75 μmol/L,说明耐药细胞展现更强TAM抗性。测序结果显示,耐药细胞中差异表达的circRNAs 46个,GO功能分析涉及肿瘤细胞外基质、蛋白质类泛素化、细胞黏附和细胞迁移等过程,主要信号通路为Notch、Rap1、ErbB、FoxO和PI3K等通路。【结论】本研究成功构建犬乳腺肿瘤TAM耐药细胞系CHMm^TAM,耐药细胞展现更强的增殖能力和TAM抗性。高通量筛选了亲本和耐药细胞中差异表达的circRNAs,耐药性产生可能通过Notch、Rap1和ErbB通路影响细胞信号转导、细胞泛素化、细胞转移等生物学过程,最终参与肿瘤耐药。

【目的】建立中药复方参姜止痢合剂的鉴别和含量测定分析方法,为制剂的质量标准提供依据。【方法】采用薄层色谱法(TLC)对参姜止痢合剂中的苦参、干姜做定性鉴别研究;使用高效液相色谱法(HPLC)对参姜止痢合剂中苦参碱、氧化苦参碱进行定量研究。【结果】TLC结果显示,参姜止痢合剂中的苦参、干姜薄层色谱图中供试样品的斑点清晰,与其对应的对照品或对照药材在薄层板相同位置显示一致斑点,阴性对照样品不显示特征斑点。HPLC结果显示,液相色谱图中苦参碱和氧化苦参碱峰型良好,苦参碱在5~100 μg/mL(R²=0.9999)、氧化苦参碱在5~100 μg/mL (R²=0.9999)范围内线性关系良好;仪器精密度测试中相对标准偏差(RSD)值(n=6)为1.56%,说明该套仪器精密度良好,可满足后续含量测定的要求;在样品溶液制备好后0、6、12、24、36、48 h各进样一针,计算RSD(n=6)为2.25%,表明供试品溶液中苦参碱和氧化苦参碱总含量在室温下于48 h内保持稳定;重复性试验结果RSD(n=6)为2.47%,表明样品制备方法重复性良好;苦参碱和氧化苦参碱总含量平均加样回收率为99.17%,RSD(n=6)为2.84%。【结论】本试验建立的参姜止痢合剂的定性及定量分析方法重现性好,结果准确可靠,可对参姜止痢合剂中苦参和干姜进行鉴别,对苦参碱和氧化苦参碱含量进行测定,有效控制其质量。

致病性大肠杆菌作为肠杆菌科成员和人兽共患病病原体之一,在一定条件下可通过多种途径引起人和动物感染并引发不同的大肠杆菌病病型。由于致病性大肠杆菌的血清型和毒力因子众多、耐药趋势严峻、存在生物被膜等因素导致大肠杆菌病的流行趋势复杂且疫苗研发困难,给国内外的畜禽养殖业带来一定的经济损失。高致病性岛(high-pathogenicity island,HPI)最早发现于耶尔森菌,被证实是其毒力表型所必需的基因组岛,为强毒力岛。由于细菌的水平转移机制让该毒力岛在其他肠杆菌科中被广泛检出。其中HPI毒力岛也在致病性大肠杆菌如肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage Escherichia coli,EHEC)、产志贺毒素大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)等中被大量检出,被证实影响致病性大肠杆菌毒力,参与致病性大肠杆菌铁元素摄取和介导宿主免疫反应等。为进一步了解HPI毒力岛在致病性大肠杆菌中的铁元素调控机理、致病特性、介导的细胞免疫反应和水平转移途径,现从HPI毒力岛结构、如何调控耶尔森菌素铁载体、HPI毒力岛致病性及调控细胞免疫反应、HPI毒力岛的水平转移进行概述,以期望为大肠杆菌的致病机理及大肠杆菌病的防控提供帮助。

【目的】探讨地菍总黄酮对高脂饮食诱导非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型大鼠脂代谢的影响。【方法】将60只SPF级雄性大鼠随机分成空白组、模型组、奥利司他组以及地菍总黄酮高、中、低剂量组,每组10只。空白组大鼠饲喂基础饲粮,其余各组饲喂高脂饲粮,奥利他司组给予60 mg/kg奥利他司,地菍总黄酮高、中、低剂量组分别给予750、500、330 mg/kg地菍总黄酮,每天以0.1 mL/10 g灌胃体积给予相应的药物,连续给药42 d,空白组、模型组给予等体积蒸馏水。记录各组大鼠的一般状况,给药结束后检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性及脂联素(ADP)、瘦素(LEP)水平,并统计胰岛素敏感指数(ISI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);检测肝脏组织中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量;油红O染色观察肝脏病理变化;用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分别检测各组大鼠肝脏中过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂联素受体2(AdipoR2)、p38的mRNA和蛋白表达量。【结果】与空白组相比,模型组大鼠血清ALT、AST活性及LEP、FINS、FBG、HOMA-IR水平极显著或显著升高(P＜0.01;P＜0.05),ADP、ISI水平极显著下降(P＜0.01),肝脏中脂肪沉积较多,成功构建NAFLD大鼠模型。与模型组相比,奥利司他组、地菍总黄酮高剂量组大鼠血清ALT、AST活性以及LEP、FINS、FBG、HOMA-IR水平显著或极显著下降(P＜0.05;P＜0.01),ADP、ISI水平极显著升高(P＜0.01);奥利司他组及地菍总黄酮高、中、低剂量组肝脏TC和TG含量均极显著或显著降低(P＜0.01;P＜0.05),肝脏中脂肪沉积较少,且PPARγ、AdipoR2、p38的mRNA和蛋白水平均极显著升高(P＜0.01)。【结论】地菍总黄酮可明显改善高脂饮食诱导大鼠的NAFLD,其作用机制可能与其参与调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗、调控PPARγ/AdipoR2/p38/信号通路相关。