【目的】研究TP53凋亡效应因子(PERP1)在卵泡发育中的调控作用及表达机制。【方法】以蛋鸡卵巢组织为材料,克隆蛋鸡PERP1基因CDS区全长序列,并构建PERP1基因过表达载体,通过转染鸡卵泡颗粒细胞,采用实时荧光定量PCR检测转染后PERP1基因,增殖凋亡相关基因BCL2、c-Myc,以及氧化应激相关基因SOD2、CAT的相对表达量。利用3个在线生物信息学分析软件分别预测鸡PERP1基因核心启动子区,并根据预测结果设计6个启动子缺失片段引物,以蛋鸡血液组织为材料,克隆PERP1基因5'-UTR的6个启动子缺失片段并构建重组质粒,并以荧光素酶报告基因试验验证启动子活性区域位置。采用4个转录因子在线预测软件进行启动子活性区转录因子的预测分析。【结果】本研究成功获得鸡PERP1基因的CDS区全长序列并成功构建了PERP1基因的过表达载体。PERP1基因过表达后,与对照组相比,抗凋亡基因BCL2和促增殖基因c-Myc表达量极显著下调(P＜0.01),抗氧化应激基因CAT和SOD2的相对表达量无显著差异(P＞0.05)。生物信息学软件预测和荧光素酶报告载体试验结果表明,PERP1基因核心启动子位于CDS区上游(―441/―71 bp)的位置。转录因子预测结果发现Sp1、ZEB1、Zic3、c-Jun、AP-2alpha、AP-1、NF-1、c/EBPalp、Adf-1、HNF-3、CACCC-bi、c-Myc和Smad4共13个候选转录因子。【结论】PERP1基因具有促进颗粒细胞凋亡的功能,调控该基因的表达对卵泡发育具有重要意义。

【目的】基于PI3K/Akt通路研究含凝血酶敏感素基序的去解联金属蛋白酶1(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1,ADAMTS1)在产双胎和单胎蒙古羊发情周期不同阶段卵巢内的表达规律,探究ADAMTS1基因影响蒙古羊繁殖性状的作用机制。【方法】选取经产2次的双胎和单胎蒙古羊共40只,自然发情,确定母羊发情期和间情期,分为双胎发情期、双胎间情期、单胎发情期和单胎间情期组,每组各10只羊。利用注射器抽取2~3岁蒙古羊颗粒细胞,分为对照组和试验组,对照组不添加药物,试验组添加15 μmol/L LY294002处理颗粒细胞,分别在24、48和72 h测定细胞活力。通过实时荧光定量PCR技术检测母羊卵巢组织和颗粒细胞内ADAMTS1、PI3K、PTEN、Akt、RPS6、Bcl-2和BAX基因的相对表达量;通过Western blotting技术检测卵巢和颗粒细胞内ADAMTS1、PI3K和Akt蛋白的表达丰度。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,双胎发情期组ADAMTS1、Bcl-2基因表达量均显著高于其余各组(P＜0.05);双胎发情期组和双胎间情期组PI3K、Akt和PTEN基因表达量均显著高于单胎发情期组和单胎间情期组(P＜0.05);单胎间情期组RPS6基因表达量显著低于其余各组(P＜0.05);间情期与发情期相比,BAX基因表达显著上调(P＜0.05)。Western blotting 结果显示,双胎发情期ADAMST1蛋白表达量显著高于其余各组(P＜0.05);双胎组与单胎组相比,PI3K和Akt蛋白均表达上调,其中,双胎发情期和双胎间情期PI3K蛋白表达量均显著高于单胎发情期组和单胎间情期组(P＜0.05),双胎间情期Akt蛋白表达量最高,显著高于其余各组(P＜0.05)。与对照组相比,试验组蒙古羊颗粒细胞形态异常,细胞增殖缓慢,且ADAMTS1、PI3K和Akt基因和蛋白的相对表达量均显著降低(P＜0.05)。【结论】ADAMTS1、PI3K和Akt基因和蛋白在蒙古羊卵巢和颗粒细胞内的表达趋势一致,呈正向相关关系,证明ADAMTS1基因PI3K/Akt轴在蒙古羊产双胎性状中发挥重要作用。

【目的】克隆疣鼻天鹅Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)基因,并对其编码蛋白进行生物信息学分析,为进一步探索疣鼻天鹅TLR4蛋白抗病原微生物免疫机制提供重要参考依据。【方法】利用PCR扩增并克隆疣鼻天鹅TLR4基因CDS序列,应用NCBI-BLAST、Mega-X软件进行序列比对并构建系统进化树;利用ProtParam、SWISS-MODEL等软件预测TLR4基因编码蛋白的结构、功能及与宿主蛋白的相互作用关系,并进行GO功能和KEGG通路富集分析。【结果】试验成功克隆疣鼻天鹅TLR4基因CDS区序列,全长2 550 bp,已提交至NCBI,登录号为:OP908241。疣鼻天鹅TLR4基因CDS区序列中存在79个稀有密码子,其中含6段连续稀有密码子,编码849个氨基酸,与灰雁和鸿雁相似度较高,亲缘关系最近。TLR4蛋白的跨膜结构域位于第647―667位氨基酸处,N-端包含由36个氨基酸组成的信号肽,信号肽切割位点在第36―37位氨基酸之间,置信度为67.85%,含有10个N-糖基化位点和85个磷酸化位点,是亲水性蛋白,主要存在于细胞质中,与人TLR4蛋白有相似的三级结构,相似率为45.48%。TLR4蛋白共存在10个主要互作蛋白,富集得到96个GO功能条目和7条KEGG通路,其中GO功能条目包括物种间相互作用、免疫反应、应激反应、信号转导等;KEGG通路包括甲型流感、单纯疱疹病毒Ⅰ型感染及沙门氏菌感染等。【结论】疣鼻天鹅TLR4基因与灰雁和鸿雁亲缘关系最近,有明显的密码子种属选择性,含有6段连续稀有密码子,其蛋白存在跨膜结构域和信号肽,并与天然免疫应答、信号转导和应激反应密切相关。

【目的】筛选新吉细毛羊和小尾寒羊体内差异微小RNAs(microRNAs,miRNAs),研究miRNAs和靶基因对羊毛纤维机制表达的调控模式。【方法】选取两种毛细度存在显著差异的新吉细毛羊(XFWS)和小尾寒羊(SXW),采集血浆中外泌体进行转录组测序,构建文库并鉴定miRNAs,使用edgeR包对miRNAs进行差异表达分析,使用miRanda和Targetscan软件预测miRNAs的靶基因,对靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,对差异miRNAs靶基因进行miRNAs-mRNA互作调控网络分析,使用实时荧光定量PCR对转录组数据中miRNAs进行验证。【结果】新吉细毛羊和小尾寒羊血浆外泌体中存在1 019个miRNAs,其中已知miRNAs 112个,新预测miRNAs 907个,经筛选存在差异表达miRNAs 364个,其中与羊毛细度呈正相关性基因62个,呈负相关性基因302个。经多数据库比对获得靶基因的注释信息18 996个,GO功能富集分析显示,17 193个注释靶基因富集到6 608个条目中;KEGG通路分析显示其富集在276个通路之中,经蛋白互作分析找到与羊毛纤维机制表达相关miRNAs 5个及靶基因42个。实时荧光定量PCR验证差异miRNAs结果显示,oar-miR-218a、oar-miR-370-3p、oar-miR-133、oar-miR-29a、oar-miR-27a、oar-miR-485-3p、oar-miR-22-3p、oar-miR-23a、oar-miR-148a、oar-miR-412-3p在新吉细毛羊体内表达量均显著高于小尾寒羊(P＜0.05),oar-miR-26a、oar-miR-29b、oar-miR-329b-3p、oar-miR-409-3p、oar-miR-30a-3p在小尾寒羊体内表达量均显著高于新吉细毛羊(P＜0.05),与转录组测序结果一致。【结论】新吉细毛羊和小尾寒羊体内存在oar-miR-218a、oar-miR-370-3p、oar-miR-133等364个差异miRNAs,其中oar-miR-133、oar-miR-150、oar-miR-127、oar-miR-23a、oar-miR-370-3p与其42个靶基因共同参与羊毛纤维机制表达,FGFR2、NOTCH1、SHH参与多通路调节,在联级调节中起重要作用。

【目的】分析产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)感染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)初期宿主细胞内环状RNA(circularRNA,circRNA)的表达谱变化,并探究其调控机制。【方法】采用Illumina PE150测序平台对ETEC感染IPEC-J2细胞进行转录组测序,利用生物信息学在线软件筛选出差异表达circRNAs,经过GO功能和KEGG通路富集分析筛选出ETEC感染相关circRNAs,用IRESfinder和PFAM 33.1软件进行circRNAs编码潜能预测;随机挑选5个差异表达circRNAs,用实时荧光定量PCR验证circRNAs表达情况及核糖核酸酶R(RNase R)消化结果。【结果】转录组测序结果显示,共获得201个差异表达circRNAs,其中95个表达上调和106个表达下调。GO功能富集分析表明,ETEC感染初期circRNAs来源基因主要影响细胞形态、细胞代谢和泛素蛋白连接酶活性等功能。KEGG通路富集分析显示,circRNAs可能参与氨基酸代谢途径、泛素介导的蛋白质水解通路、黏合连接和肌动蛋白细胞骨架调节等信号通路。circRNAs编码潜能预测发现4个具有编码潜能的circRNAs,其中novel_circ_0009996和来源基因TNFAIP3共同富集在NF-κB和TNF信号通路。实时荧光定量PCR结果显示,5个circRNAs的表达水平与测序结果一致,差异表达circRNAs均为环状RNA分子,测序结果准确可靠。【结论】ETEC感染IPEC-J2细胞初期差异表达circRNAs和其来源基因主要参与炎症反应、基因表达的转录后调控、细胞免疫过程、细胞骨架、细胞增殖和凋亡等相关生物过程,其中novel_circ_0009996具有编码潜能,主要富集在NF-κB和TNF信号通路。研究结果为深入探究circRNA在ETEC感染初期的调控机制提供理论基础。

【目的】克隆新西兰白兔组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)与CTSS基因CDS区序列并进行生物信息学分析,探究其在新西兰白兔不同组织中的表达规律。【方法】采用PCR法扩增并克隆CTSB、CTSS基因CDS区序列,使用Mega 7.0软件构建系统进化树并分析氨基酸序列相似性;利用生物信息学软件分析CTSB、CTSS蛋白理化性质、跨膜结构、信号肽位点及亚细胞定位情况;用实时荧光定量PCR检测CTSB、CTSS基因在新西兰白兔不同组织中的表达量。【结果】新西兰白兔CTSB、CTSS基因CDS区序列长分别为1 020、1 023 bp,共编码339、340个氨基酸,蛋白分子质量分别为37.627、38.253 ku,理论等电点为5.53、8.40,不稳定系数为30.76、32.38,分别为酸性及碱性蛋白。新西兰白兔CTSB、CTSS基因氨基酸序列分别与猪、马的亲缘关系最近,与鸡亲缘关系较远。CTSB、CTSS蛋白二级结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,二者三级结构预测结果与二级结构一致,均为亲水性蛋白;CTSB蛋白信号肽剪切位点位于第17—18位氨基酸处,含有1个N-端Propeptide-C1结构域与1个Peptidase-C1A-C结构域;CTSS蛋白信号肽剪切位点位于第25—26位氨基酸处,含有1个Inhibitor-129结构域与1个Peptidase-C1结构域。亚细胞定位结果表明,CTSB、CTSS蛋白均主要分布于细胞质(包括细胞壁)内。实时荧光定量PCR结果显示,CTSB基因在腹脂和肝脏组织中表达量较高,CTSS基因在脾脏组织中表达量最高,均显著高于其他组织(P＜0.05)。【结论】成功克隆新西兰白兔CTSB、CTSS基因CDS全长序列,揭示了CTSB、CTSS基因在新西兰白兔不同组织中的表达水平并初步分析了其生物学功能,为进一步研究家兔CTSB、CTSS基因功能及调控机制提供了基础和参考。

乳房炎是乳牛的常见疾病,其形成原因较多。隐性乳房炎发病过程中不产生明显的临床表现,因而会造成更多的经济损失,为了尽可能减少损失,需采用合适的方法对隐性乳房炎加以防治。传统的检测手段由于其自身的局限性难以全面阐述其机制,与此同时,随着生物信息技术的发展,利用组学技术能很好地探索隐性乳房炎的致病机制及宿主的抗病机制。其中,代谢组学能反映机体的营养状况、药物和环境污染物的作用及其他外部因素的影响,并以此为依据来解释隐性乳房炎的生理病理变化;蛋白质组学能分析患病乳牛样本细胞中所有蛋白的表达,并阐明该蛋白的特性及结构功能,为诊断隐性乳房炎提供潜在的生物标志物;基因组学能对单核苷酸多态性(SNPs)等信息与性状进行关联分析,从而实现关键基因的定位;而转录组学可检测到特殊环境及特殊生理状态下某些细胞、组织及生物体内的全部RNA表达量;表观组学能在不改变个体DNA序列的前提下使基因表达发生变化,从而起到调控性状的作用。为更好地了解乳牛隐性乳房炎的致病机制及宿主的抗病机制,笔者综述了组学技术在乳牛隐性乳房炎领域的研究进展,以期为今后更深入地探索乳牛隐性乳房炎提供参考。

【目的】探讨从胶红酵母中提取分离纯化获得的虾青素对免疫抑制小鼠免疫功能的影响,为虾青素用于预防免疫抑制疾病或作为畜禽替抗饲用产品开发应用提供理论依据。【方法】从雷州半岛近岸海域分离并筛选胶红酵母ZTHY2提取获得虾青素。选取60只C57BL/6小鼠,随机分为6组:空白对照组、环磷酰胺组、酵母β-葡聚糖组及虾青素低、中、高剂量组。第1~14天,酵母β-葡聚糖组灌胃100 mg／kg酵母β-葡聚糖,虾青素低、中、高剂量组分别灌胃30、60、100 mg/kg虾青素,空白对照组及环磷酰胺组灌胃生理盐水;第15~21天,除空白对照组(灌胃生理盐水)外,各组小鼠腹腔注射50 mg/kg环磷酰胺。试验结束后,采集小鼠脾脏及胸腺,计算其脏器系数和脾脏T、B淋巴细胞增殖情况,并观察脾脏、胸腺组织学变化情况;测定血清中白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、免疫球蛋白A(IgA)、IgG、IgM、CD4、CD8、CD19、CD20、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量,过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,以及脾脏中活性氧(ROS)水平。【结果】与空白对照组相比,环磷酰胺组小鼠脾脏指数、胸腺指数均极显著降低(P＜0.01),脾脏红、白髓界限不清,脾淋巴细胞数量减少;胸腺皮质、髓质不清,结构破坏;脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力均极显著降低(P＜0.01);血清细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ、CD4、CD8、CD19、CD20及免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量显著或极显著降低(P＜0.05;P＜0.01),CAT、SOD活性与GSH含量均极显著降低(P＜0.01),MDA及ROS水平均极显著升高(P＜0.01)。与环磷酰胺组相比,随着给药剂量的增加,虾青素组小鼠脾脏和胸腺组织结构逐渐清晰,脾脏指数和胸腺指数均极显著升高(P＜0.01);虾青素对刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)诱导的脾脏淋巴细胞增殖有极显著促进作用(P＜0.01);可极显著或显著提高免疫抑制小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ、CD4、CD8、CD19、CD20、IgA、IgG、IgM含量(P＜0.01;P＜0.05),极显著增加血清中SOD、CAT活性及GSH含量(P＜0.01),极显著降低ROS和MDA水平(P＜0.01),且100 mg/kg虾青素效果最佳。【结论】100 mg/kg虾青素能明显提高免疫抑制小鼠的免疫功能与抗氧化能力,有效改善环磷酰胺引起的免疫抑制,可用于预防免疫抑制疾病和作为畜禽替抗饲料添加剂开发。

【目的】对荷斯坦牛脂肪来源的间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)进行体外分离与培养,研究其生物学特性,为干细胞临床研究提供一种新型可用的种子细胞。【方法】无菌收集2月龄荷斯坦牛胚胎的腹股沟脂肪组织,使用Ⅰ型胶原酶消化收集细胞进行培养,使用荧光抗体技术和RT-PCR检测细胞膜表面特异性标记物(CD29、CD44、CD73、CD166、CD34、CD45),利用纯化后的细胞绘制P4、P10、P16代生长曲线并计算群体倍增时间,利用细胞克隆形成试验计算克隆形成率,染色体核型分析判断细胞遗传是否稳定,通过向AD-MSCs培养皿中添加诱导液,验证其向成脂、成骨、成软骨的分化潜能。【结果】体外分离培养的细胞呈贴壁漩涡状生长,细胞形态为长梭形。荧光抗体技术和RT-PCR检测结果表明,CD29、CD44、CD73和CD166细胞膜表面抗原被表达,CD34和CD45不被表达,确定分离的细胞为AD-MSCs。绘制的细胞生长曲线为S型,P4、P10、P16代细胞群体倍增时间分别为33、35、44 h,克隆形成率分别为(51.67±1.53)%、(38.00±2.00)%、(25.00±1.00)%,2个指标在3个代次间差异均显著(P＜0.01;P＜0.05)。核型结果表明,AD-MSCs为正常二倍体(2n=60,XX),染色体形态均为端着丝粒,无畸变。诱导分化结果显示,在体外AD-MSCs具有成脂、成骨、成软骨的分化潜能,分别出现明显的脂滴、钙结节和软骨团,且分别表达成脂诱导基因脂蛋白脂肪酶(LPL)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)、成骨诱导基因Ⅰ型胶原蛋白(COL Ⅰ)和骨桥蛋白(OPN)、成软骨诱导基因SRY样HMG盒9(SOX-9)和软骨蛋白聚糖抗体(ACAN)。【结论】用荷斯坦牛胚胎能成功在体外分离原代AD-MSCs,细胞形态具有典型的间充质干细胞形态,具有成脂、成骨、成软骨细胞的分化潜能,且细胞具有增殖能力快、稳定等特点,可以为组织和器官修复提供种质资源。

【目的】探讨蒲公英甾醇对黄曲霉毒素B₁(AFB₁)诱导的鸡原代肝细胞氧化损伤的保护作用及机制,为应用蒲公英甾醇防治AFB₁中毒提供理论依据。【方法】采用组织块酶消化法分离鸡原代肝细胞并进行PAS糖原染色鉴定,通过CCK-8法绘制肝细胞生长曲线;通过MTT法测定AFB₁对鸡肝细胞的毒性,结合测定肝细胞上清液中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平,以确定AFB₁的体外建模浓度。通过MTT法确定蒲公英甾醇的安全给药浓度后,将试验分为6组:空白对照组、模型组、蒲公英甾醇剂量组(高、中、低剂量组)、阳性对照组。建立AFB₁诱导的鸡原代肝细胞损伤模型并给予药物,通过试剂盒测定细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)以及还原型谷胱甘肽(GSH)水平。通过实时荧光定量PCR法测定Keap1/Nrf2信号通路关键基因血红素加氧酶-1(HO-1)、NADPH醌氧化还原酶1(NQO1)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)和核转录因子E2相关因子2(Nrf2)表达量。【结果】试验成功分离鉴定鸡原代肝细胞,在培养24~72 h细胞活力较高;确定0.05 μg/mL作为AFB₁体外诱导鸡原代肝细胞损伤的建模浓度;确定20、10、5 μg/mL作为蒲公英甾醇高、中、低剂量组的给药浓度;与模型组相比,蒲公英甾醇可极显著降低AFB₁所致鸡原代肝细胞氧化应激相关指标ROS和MDA含量(P<0.01),极显著提高抗氧化物SOD活性(P<0.01);极显著或显著提高AFB₁所致鸡原代肝细胞中HO-1、NQO1和Nrf2基因(除低剂量组外)表达量(P＜0.01;P＜0.05),降低Keap1基因表达量。【结论】蒲公英甾醇通过调控鸡原代肝细胞Keap1/Nrf2信号通路提高其抗氧化能力,从而对AFB₁诱导的鸡原代肝细胞氧化损伤起到保护作用。

【目的】研究复合酶与枯草芽孢杆菌对黄羽肉鸡生长性能、肉品质和肝脏功能的影响。【方法】选用1 200只1日龄快大型黄羽肉公鸡,随机分为5组,每组6个重复,每个重复40只鸡。对照组饲喂基础饲粮,其他组依次在基础饲粮中添加20 mg/kg维吉尼亚霉素(抗生素组)、500 mg/kg复合酶(复合酶组)、200 mg/kg枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌组)以及500 mg/kg复合酶＋200 mg/kg枯草芽孢杆菌(联用组),试验期63 d。分别于21、42和63日龄以重复为单位对肉鸡空腹称重并统计采食量,计算生长性能;21和63日龄从每个重复选取2只鸡屠宰,收集血液和肝脏组织样品,测定生化指标;21日龄收集盲肠内容物测定菌群数量;63日龄取胸肌评价肉品质。【结果】与对照组相比,复合酶组、枯草芽孢杆菌组和联用组黄羽肉鸡的生长性能均无显著差异(P＞0.05),但均可显著提高21日龄黄羽肉鸡的肝脏指数(P＜0.05),并可显著降低63日龄黄羽肉鸡肌肉滴水损失(P＜0.05);复合酶或枯草芽孢杆菌单独添加均可显著降低21日龄黄羽肉鸡盲肠微生物菌群中肠球菌属菌群数量(P＜0.05),并可显著降低63日龄黄羽肉鸡血浆尿素氮(BUN)水平(P＜0.05),显著提高肝脏总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性(P＜0.05);复合酶单独添加可显著降低21日龄黄羽肉鸡血浆BUN水平(P＜0.05);枯草芽孢杆菌单独添加可显著提高21日龄黄羽肉鸡肝脏胆碱酯酶(CHE)活性(P＜0.05)。与抗生素组相比,复合酶与枯草芽孢杆菌联合添加对63日龄黄羽肉鸡肝脏指数无显著影响(P＞0.05),但显著增加了黄羽肉鸡24 h肉色黄度值(P＜0.05)。与联用组相比,复合酶或枯草芽孢杆菌单独添加均可显著提高63日龄黄羽肉鸡肝脏中GSH-Px和琥珀酸脱氢酶(SHD)活性(P＜0.05),但对黄羽肉鸡盲肠微生物菌群组成均无显著影响(P＞0.05)。【结论】饲粮单独添加复合酶或枯草芽孢杆菌均可增强黄羽肉鸡肝脏抗氧化能力和代谢功能,降低盲肠有害菌数量,改善黄羽肉鸡肉品质,但两者联合添加时并没有表现出协同作用。

【目的】探究氧化钙(CaO)和碳酸钠(Na₂CO₃)联合预处理枯叶期芦苇秸秆的木质素降解最佳工艺条件及其结构变化。【方法】试验在添加2% Na₂CO₃的基础上,选取处理时间、处理温度、料液比和CaO添加量4个因素进行单因素梯度试验,探究其对木质素及半纤维素去除率的影响;根据单因素试验结果进行Box-Behnken响应面优化试验,探究木质素降解的最佳预处理条件;随后通过扫描电镜(SEM)、傅里叶红外光谱(FTIR)和X-射线衍射(XRD)分析芦苇秸秆在最佳预处理条件下的结构变化。【结果】不同处理时间、处理温度和CaO添加量对芦苇秸秆木质素和半纤维素去除率均有显著影响(P＜0.05),不同料液比无显著影响(P＞0.05);响应面优化结果显示回归模型极显著(P＜0.01),3种因素对木质素去除率均有极显著影响(P＜0.01);3种因素对木质素去除率影响由大到小依次为处理温度、CaO添加量、处理时间。Na₂CO₃添加量为2%、料液比1∶3时,预处理最佳工艺条件为:CaO添加量8.44%,处理时间5.52 h,处理温度49.58 ℃,在此工艺条件下芦苇秸秆木质素去除率的模型预测值为24.97%,试验验证结果为23.75%,与预测值接近。优化条件处理后,SEM结果显示芦苇秸秆表面发生破损,孔隙增大、增多;FTIR结果显示,芦苇秸秆的半纤维素、木质素对应化学键的吸收峰强度均降低;XRD结果显示,芦苇秸秆的纤维素相对结晶指数(CrI)由37.21%变为46.66%。【结论】采用响应面法优化CaO及Na₂CO₃联合预处理芦苇秸秆的工艺条件合理可行,预处理后的芦苇秸秆其表面形态结构、木质纤维素的化学结构和纤维素结晶结构均发生了明显变化。本试验结果可为非常规饲料资源高值化利用提供技术支撑。

【目的】试验旨在研究复合植物精油对产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道屏障和抗氧化功能的影响。【方法】将288只1日龄、体重相近(38 g±2 g)、健康的罗斯308肉鸡,随机分成4个处理组,每个处理6个重复,每个重复12只鸡。对照组和感染组饲喂基础饲粮,感染＋CTA(肉桂醛、百里香酚和茴香醛按照质量比为1∶3∶1组成)和感染＋CAT(肉桂醛、茴香醛和百里香酚按照质量为1∶3∶1组成)组分别在基础饲粮中添加100 mg/kg复合植物精油。感染组、感染＋CTA组、感染＋CAT组肉鸡在14~20日龄连续经口灌服1×10⁸ CFU/mL 产气荚膜梭菌(1 mL/d),对照组肉鸡灌喂等体积的疱肉培养基。试验期42 d。于试验第21、28天,采集肉鸡血液、十二指肠、空肠、回肠样品,用以检测血清二胺氧化酶(DAO)活性与血浆抗氧化指标,观察肠道形态结构,检测空肠屏障相关基因的mRNA水平和抗氧化指标。【结果】与对照组相比,产气荚膜梭菌感染提高了21、28日龄肉鸡血清DAO活性,降低了21日龄空肠与28日龄十二指肠的绒毛高度(VH)与隐窝深度(CD)的比值(VH/CD)(P＜0.05)。与感染组相比,饲粮中添加CTA、CAT均可缓解因产气荚膜梭菌感染引起的血清DAO升高及回肠VH降低(P＜0.05);添加CTA上调了21日龄肉鸡空肠闭合基因(occludin)、紧密连接蛋白-1(claudin-1)、黏蛋白-5ac(mucin5ac)的mRNA相对表达量,上调了28日龄肉鸡闭合连接蛋白-1(ZO-1)的mRNA相对表达量(P＜0.05);添加CAT上调了28日龄肉鸡ZO-1、occludin、claudin-1、脂肪酸结合蛋白2(FABP2)的mRNA相对表达量(P＜0.05);此外,添加CTA和CAT均提高了28日龄感染肉鸡血浆谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性(P＜0.05)。【结论】饲粮中添加复合植物精油可改善产气荚膜梭菌感染肉鸡的肠道屏障和抗氧化功能。

【目的】在肉鸡养殖中饲喂丁酸梭菌具有促进生长和提高饲料转化效率的作用,但其机制尚不明确。本研究采用转录组测序技术和组织学染色方法,研究饲粮中添加丁酸梭菌对肉鸡盲肠黏膜的影响,为丁酸梭菌的应用提供试验基础和理论支持。【方法】选取120只爱拔益加(AA)肉鸡,随机分为2组,每组6个重复,每个重复10只鸡,对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中添加丁酸梭菌(1×10⁹ CFU/kg),试验期为28 d,全程自由采食和饮水。在28日龄时每个重复随机选取1只肉鸡处死,采集盲肠黏膜样品,应用RNA测序技术检测盲肠黏膜组织的转录组学特征,应用组织染色镜检分析盲肠黏膜的形态变化。【结果】试验共鉴定出123个差异表达基因,其中上调70个,下调53个;GO功能富集分析发现,与物质转运、细胞活力和抗氧化应激相关的功能基因显著或极显著富集(P＜0.05;P＜0.01);KEGG通路富集分析显示,注释到维生素、氨基酸和O-聚糖的生物合成以及apelin信号通路的相关基因最为丰富。与对照组相比,试验组肉鸡盲肠黏膜中屏障功能相关蛋白如密封蛋白2(Claudin 2)、Claudin 15、Claudin 19、Claudin 23和紧密连接蛋白1(TJP 1)、TJP 2、TJP 3以及黏蛋白1(Mucin 1)基因的相对表达量显著或极显著增加(P＜0.05;P＜0.01);试验组盲肠黏膜HE和PAS染色镜检显示其肠腺深度、黏膜层厚度和肌层厚度以及杯状细胞的数量和密度均高于对照组。【结论】饲喂丁酸梭菌能够提高肉鸡盲肠黏膜的转运功能,增强抗氧化应激能力以及肠黏膜屏障功能,从而改善肠道健康和促进生长性能。

【目的】研究饲粮中不同营养水平和饲喂方式对蜀兴1号商品兔生长性能、屠宰性能及经济效益的影响。【方法】选择360只28日龄蜀兴1号商品兔,随机分为4组,每组5个重复,每个重复18只(公母各半)。1组高营养水平-自由采食,2组高营养水平-限制饲喂,3组低营养水平-自由采食,4组低营养水平-限制饲喂。77日龄饲养试验结束时每组随机选择12只屠宰,测定宰前活重、全净膛重、半净膛重等屠宰性能。【结果】①低营养水平组的56、77 d体重及28~56、28~77 d日增重显著高于高营养水平组(P＜0.05),28~56、28~77 d的腹泻率显著低于高营养水平组(P＜0.05)。自由采食条件下的56、77 d体重、28~56 d日增重和料重比、56~77 d料重比以及28~77 d日增重均显著高于限饲组(P＜0.05),56~77 d日增重、28~56 d期间的腹泻率以及28~77 d期间的腹泻率和死亡率均显著低于限饲组(P＜0.05)。营养水平与饲喂方式的互作效应对蜀兴1号商品兔28~56 d和28~77 d的腹泻率有显著影响(P＜0.05),对其余生长性能指标无显著影响(P＞0.05)。②自由采食组的宰前活重、全净膛重和半净膛重显著高于限饲组(P＜0.05)。高营养水平的宰前活重显著低于低营养水平,屠宰性能无显著差异(P＞0.05)。饲喂方式显著影响蜀兴1号商品兔的屠宰性能(P＜0.05),自由采食组的各指标高于限饲组。③不同营养水平和饲喂方式对蜀兴1号商品兔经济效益无显著影响(P＞0.05)。【结论】营养水平和饲喂方式显著影响蜀兴1号商品兔的体重和腹泻率。采用低营养水平进行自由采食饲喂可获得最佳收益。

马肉具有高蛋白质、低脂肪、低胆固醇等特点,可以作为一种优质的蛋白质来源。目前消费者对于马肉不熟悉,国内消费量并不高,马肉大部分以出口为主,且加工方式单一,主要以新疆地区的熏马肉为主。因此,进一步明确马肉营养价值、食用功效对马肉产品的开发利用以及促进马产业的转型和发展具有重要意义。不同品种马肉水分、灰分、蛋白质和脂肪含量不同,不同年龄马肉化学组成不同;日粮营养水平不同,马肉的嫩度、多汁性、风味等肉品质也不同;肌肉部位不同,颜色、嫩度和营养成分有所差异;在饲粮中添加植物添加剂可改变饲料消化率,进而改善肉品质;通过腌制、电刺激或酶处理等加工技术能够有效改善马肉嫩度,提高马肉品质。笔者总结了马肉品质及营养成分特点,并从遗传因素、个体因素、营养水平、屠宰、加工及贮藏等方面对马肉品质及营养价值的影响进行综述,以期为马肉品质改善和产品开发提供参考依据。

【目的】研究补饲中草药饲料添加剂、活性干酵母对哺乳犊牛生长性能及血液指标的影响。【方法】选取24头体重(93.06 kg±11.20 kg)、月龄(3.5月龄)相近,体况良好的延边黄牛哺乳犊牛,采用完全随机试验设计,将犊牛随机分成3组,每组8头(公犊牛5头、母犊牛3头)。对照组饲喂基础饲粮,中药组在对照组的基础上添加0.5%中草药饲料添加剂,酵母组在对照组的基础上按照1 g/d的标准添加拉曼活性干酵母。试验期共31 d,其中预试期10 d,正试期21 d。在试验期间采集饲料样和粪样,试验结束后采集血样,测定犊牛的采食量、消化率及血清指标。【结果】与对照组相比,①中药组与酵母组平均日增重(ADG)均显著提高(P＜0.05);②中药组与酵母组犊牛干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗脂肪(EE)消化率均显著提高(P＜0.05);③中药组与酵母组犊牛血清生长激素(GH)与胰岛素样生长因子-1(IGF-1)含量均显著提高(P＜0.05),三碘甲状腺原氨酸(T₃)、甲状腺素(T₄)含量差异不显著(P＞0.05);④中药组血清免疫球蛋白G(IgG)含量显著提高(P＜0.05);中药组与酵母组血清中免疫球蛋白A(IgA)含量均显著提高(P＜0.05);⑤中药组与酵母组血清中白介素-1β(IL-1β)、γ干扰素(IFN-γ)含量均显著降低(P＜0.05);⑥中药组血清过氧化氢酶(CAT)活性显著升高(P＜0.05);酵母组未出现显著差异(P＞0.05)。【结论】补饲0.5%中草药饲料添加剂与1 g/d活性干酵母制剂均可在不同程度上提高哺乳犊牛生长性能,提高犊牛免疫、抗氧化能力及抗菌消炎的能力,促进犊牛生长发育。

【目的】研究不同精粗比柠条饲粮对湖羊生长性能、肉品质及肠道微生物区系的影响。【方法】试验选取2月龄左右、体重一致(15.36 kg±3.36 kg)断奶湖羊60只,平均分为3组,每组5个重复,每个重复4只羊。粗饲料组成为60％柠条、20％花生秧及20％苜蓿,3组粗饲料与精料比例分别为60∶40、50∶50、40∶60。试验预饲期10 d,正试期60 d,试验期内每隔15 d记录各组湖羊的体重;试验结束后第2天屠宰,采集3组湖羊背最长肌、股三头肌和空肠内容物,进行肉品质分析和肠道菌群检测。【结果】3组湖羊体重在15、30和45 d无显著差异(P＞0.05)。试验第60天时,60∶40组湖羊平均体重和平均日增重显著高于40∶60组(P＜0.05);50∶50组股三头肌总氨基酸含量最高(P＜0.05),各种风味氨基酸含量也较高;各组湖羊背最长肌和股三头肌各种氨基酸组成及含量均无显著差异(P>0.05);湖羊肌肉中各脂肪酸含量及比例在3组间均无显著差异(P＞0.05)。各组湖羊肠道微生物门水平主要细菌组成为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和髌杆菌门(Patescibacteria),其中厚壁菌门、变形菌门(Proteobacteia)和软壁菌门(Tenericutes)菌群丰度随饲粮中粗饲料的降低而降低(P＜0.05);在属水平上,双歧杆菌科菌属(Aeriscardovia)丰度随粗饲料比例降低有升高的趋势(0.05<P＜0.1)。【结论】柠条粗饲料与精料比例在60∶40时湖羊生长性能最高;50∶50时羊肉品质更好。饲喂不同精粗比柠条饲粮一定程度上影响肠道微生物结构。

【目的】探究陕北白绒山羊Notch2基因插入/缺失(insertion/deletion,InDel)遗传多态性及其与绒毛和生长性状的相关性,为陕北白绒山羊分子辅助育种提供理论依据。【方法】采集1 469只成年雌性陕北白绒山羊耳组织,提取基因组DNA,并测定绒长、毛长、体长、体高等绒毛与生长性状数据。参考GenBank和Ensembl数据库提供的山羊Notch2基因InDel遗传变异信息设计引物,利用PCR扩增和直接测序法检测Notch2基因17个InDels突变的多态性,并分析其与陕北白绒山羊绒毛和生长性状的相关性。【结果】陕北白绒山羊Notch2基因分别在第15内含子区的12 bp InDel(rs665021370)和第25内含子区的21 bp InDel(rs653705114)存在多态性,且2个InDels位点均存在插入/插入型(II)、杂合型(ID)和缺失/缺失型(DD)3种基因型,这2个位点均属于低度多态(P＜0.25),且处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。关联分析结果表明,Notch2基因rs665021370位点突变与陕北白绒山羊体高或体长呈显著或极显著相关(P＜0.05;P＜0.01);rs653705114位点突变与陕北白绒山羊毛长、胸宽和体高呈显著或极显著相关(P＜0.05;P＜0.01)。2个InDels位点不属于强连锁关系。【结论】Notch2基因rs665021370和rs653705114位点突变对陕北白绒山羊绒毛或生长性状有显著影响,可作为陕北白绒山羊优良性状选育的分子标记。

【目的】研究锌指BED结构域包含蛋白6(ZBED6)基因敲除对青春期小鼠骨骼肌生长发育的影响及其分子作用机制。【方法】以8周龄野生型(WT)和Zbed6基因敲除(Zbed6^-/-)C57BL/6小鼠为试验对象,采集血液,用ELISA法检测血清睾酮含量;分离骨骼肌组织并记录肌肉重、肌肉率。通过骨骼肌组织切片和免疫组化分析检测骨骼肌肌纤维面积及IGF2蛋白表达水平。通过Illumina Novaseq^TM 6000高通量测序对WT和Zbed6^-/-雌、雄小鼠进行转录组测序分析,联合小鼠ZBED6靶基因数据,筛选在Zbed6基因敲除小鼠肌肉组织中发挥作用的下游靶基因,并通过实时荧光定量PCR验证转录组测序结果中差异表达基因的可靠性。【结果】与WT小鼠相比,Zbed6^-/-雌、雄小鼠肌肉重、肌肉率均极显著增加(P＜0.01)。Zbed6基因敲除后,雌、雄小鼠骨骼肌Zbed6基因mRNA表达量显著降低(P＜0.05),IGF2的mRNA及蛋白表达量均显著或极显著增加(P＜0.05;P＜0.01),血清睾酮含量极显著升高(P＜0.01)。转录组测序结果显示,Zbed6^-/-组雄鼠骨骼肌中共筛选到38个差异表达基因,其中22个上调,16个基因下调;雌鼠骨骼肌中筛选到49个差异表达基因,其中19个基因上调,30个基因下调。共有10个差异表达基因在雌、雄小鼠中共同表达,其中Dock3、Lhx2、Brsk2、Caskin1、Gbe1为ZBED6靶基因。实时荧光定量PCR检测发现,4个差异表达基因的表达情况与转录组测序分析结果一致,证实测序结果准确可信。【结论】Zbed6^-/-促进青春期小鼠骨骼肌生长发育,增加血清睾酮含量,筛选出Dock3、Lhx2、Brsk2、Caskin1、Gbe1 5个ZBED6靶基因。研究结果为深入探究ZBED6功能提供了新的基因靶点和研究方向,有助于完善ZBED6功能图谱,为大动物品种改良和畜禽瘦肉性状遗传育种研究提供了重要的理论依据。

子宫内膜增生是雌性动物正常子宫状态的一种,但子宫内膜过度增生能引起不同程度的功能性子宫出血、胚胎着床失败以及绝经后阴道出血等,对繁殖产生消极影响,并且有发展成为子宫内膜癌的风险。类固醇激素,包括雌激素、孕激素和雄激素等,在子宫内膜增生中发挥重要作用。高浓度雌激素或长期低浓度雌激素刺激,且无孕激素抵抗,是造成子宫内膜过度增生的主要原因,雄激素与孕激素类似,有对抗雌激素的作用。子宫内膜过度增生现象也常发生于猪定时输精过程中,常用的生殖激素孕马血清促性腺激素在显著提高动物排卵数的同时通过促进卵巢雌二醇的分泌造成子宫内膜过度增生,对胚胎着床造成负面影响。目前类固醇激素在子宫内膜增生中的作用机制尚不完全清楚,作者分别介绍了子宫内膜增生的类型,简述了不同动物子宫内膜增生的研究进展,分析了类固醇激素在子宫内膜增生中的作用与可能的机理,阐述了其他因子和基因对子宫内膜增生的影响及子宫内膜增生的防治,以期为动物子宫内膜过度增生的防治提供理论参考。

【目的】探究干细胞因子(stem cell factor,SCF)对梅花鹿色素合成过程的影响。【方法】构建梅花鹿SCF基因野生型(SCF1-9)和突变型(SCF789)表达载体并转染HEK293细胞。用孵育HEK293细胞的培养液培养小鼠黑色素瘤细胞(B16),模拟SCF在机体的转运过程,检测B16细胞的黑色素含量及酪氨酸酶活性;用RT-PCR法检测小眼症转录因子M型(MITF-M)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)、TYRP2、溶质载体家族45成员2(SLC45A2)、SRY盒转录因子10(SOX10)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的mRNA表达量;用Western boltting检测MITF-M、TYR蛋白表达水平。【结果】SCF1-9组黑色素含量、酪氨酸酶活性和MITF-M、TYR、SOX10基因mRNA表达量及TYR和MITF-M的蛋白表达量与对照组、SCF789组相比均极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05)。SCF1-9组SCL45A2基因mRNA表达量与SCF789组相比显著升高(P<0.05),与对照组无显著差异(P＞0.05)。【结论】梅花鹿SCF基因通过SCF/c-kit信号通路调节色素基因MITF-M、SOX10、TYR、SLC45A2表达,促进色素合成。试验结果为进一步研究色素合成相关基因的表达调控提供理论依据。

【目的】研究四川省凉山黑绵羊群体的遗传多样性和亲缘关系,以期为当地黑绵羊种质资源保护及合理利用提供科学依据。【方法】利用PCR法扩增凉山黑绵羊线粒体细胞色素b(Cytb)基因并测序,通过BLAST比对确认序列长度和突变位点信息,结合从GenBank中下载的国内外22个绵羊品种的153条绵羊线粒体Cytb基因序列,用Mega 7.0软件进行碱基组成和遗传距离分析,并利用DnaSP 5.0软件进行遗传多样性分析。【结果】凉山黑绵羊群体Cytb基因大小为1 140 bp,未发现插入或缺失,AT含量高于GC含量;采集的60只黑绵羊的Cytb基因共存在13个变异位点,有13种单倍型,其中H2、H3为优势单倍型;凉山黑绵羊单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)和平均核苷酸变异数(K)分别为0.674、0.00120和1.371。系统发育树分析结果表明,凉山黑绵羊与乌拉黑羊遗传距离最小,与盘羊遗传距离最大。【结论】凉山州本地黑绵羊Cytb基因遗传多样性较低,其中盐源黑绵羊群体Cytb基因遗传多样性远低于布拖、普格黑绵羊群体,3个黑绵羊群体之间的亲缘关系较近,初步推测具有2个母系起源。凉山州本地黑绵羊群体与乌拉黑羊等亲缘关系最近,与盘羊亲缘关系较远。

【目的】探究绵羊信号传感器和转录激活器5A(signal transducer and activator of transcription 5A,STAT5a)基因第10内含子多态位点及其与泌乳性状的相关性,为湖羊分子标记选育提供参考依据。【方法】采集71只湖羊母羊血液,通过PCR扩增和Sanger测序法检测湖羊STAT5a基因第10内含子单核苷酸多态性(SNP)位点,并利用SAS 9.4软件分析STAT5a基因SNP位点多态性与7~56 d湖羊产奶量、乳脂率、乳蛋白率、体细胞数等性状的相关性。【结果】湖羊STAT5a基因第10内含子检测出1个SNP位点:g.41838147 A＞G,在该位点发现AA、AG和GG 3种基因型。卡方适合性检验表明,g.41838147 A＞G突变位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05)。多态信息含量(PIC)计算显示,g.41838147 A＞G位点为中度多态(0.25＜PIC＜0.50)。关联分析结果表明,g.41838147 A＞G位点的GG基因型个体7~56 d总产奶量极显著或显著高于AA、AG基因型(P＜0.01;P＜0.05),平均乳糖率显著高于AA基因型(P＜0.05);AG、GG基因型个体的平均体细胞数显著低于AA基因型(P＜0.05)。【结论】STAT5a基因第10内含子存在1个多态性位点,与湖羊总产奶量、平均乳糖率和平均体细胞数均有显著关联性。

【目的】探索蒙古马不同年龄阶段睾丸组织形态及生精上皮细胞数量变化规律,从而为蒙古马精子发生相关研究提供理论参考。【方法】采集1、2、3、4、5和6岁蒙古马睾丸组织,通过HE染色对睾丸组织、曲细精管结构进行形态学观察,并统计曲细精管、生精上皮细胞相关参数,探究其发育规律。【结果】睾丸组织学观察结果显示,1岁蒙古马睾丸组织未见成熟精子,曲细精管管腔为实心结构且管径小。2岁时出现少量成熟精子,曲细精管部分呈现空腔结构,随蒙古马年龄增长成熟精子数量逐渐增多。曲细精管直径、面积及生精细胞、支持细胞数量均随蒙古马年龄增长而增加,6岁时达最高水平,且均极显著高于1岁(P＜0.01)。【结论】蒙古马2岁时进入性成熟阶段,且随着精子发生的不断进行,各类生精上皮细胞开始出现,睾丸曲细精管面积和直径、生精细胞和支持细胞数量随年龄增长而不断增加。研究结果为确定蒙古马育种周期、提高繁殖性能等研究提供理论参考。

【目的】对猪源载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽蛋白3(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide protein 3,APOBEC3,简称A3)家族的A3Z2基因进行克隆、生物信息学分析,筛选稳定表达A3Z2的IPEC-J2细胞,研究A3Z2对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)增殖的影响,以期为研究A3Z2的抗病毒功能奠定基础。【方法】以IPEC-J2细胞总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增猪A3Z2基因CDS区,并对其进行遗传进化和生物信息学分析。构建pcDNA3.1-3×Flag-A3Z2载体,将其转染IPEC-J2细胞后经G418筛选、有限稀释法和单克隆细胞培养,获得稳定表达A3Z2的细胞株。分别采用间接免疫荧光试验和Western blotting方法鉴定A3Z2的表达,采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法分析PEDV N基因的mRNA和蛋白表达水平。【结果】猪A3Z2基因CDS区长843 bp,编码280个氨基酸,分子质量约为32.7 ku,不存在跨膜区及信号肽切割位点,主要存在于细胞核中。A3Z2蛋白二级结构由α-螺旋(27.14%)、延伸链(17.86%)、β-转角(6.43%)和无规则卷曲(48.75%)构成。通过细胞筛选获得稳定表达A3Z2的细胞株IPEC-J2-A3Z2;间接免疫荧光方法和Western blotting结果显示,A3Z2能在IPEC-J2细胞中表达。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,细胞株IPEC-J2-A3Z2中PEDV N基因的mRNA和蛋白表达均被A3Z2抑制。【结论】本研究成功克隆了猪A3Z2基因,筛选获得了IPEC-J2-A3Z2细胞株,证实了A3Z2抑制PEDV复制的作用,为研究PEDV与A3Z2相互作用的分子机制和以此为靶点筛选抗PEDV新药提供了思路。

【目的】从疑似患猫鼻咽拭子和粪便病料中分离猫嵌杯病毒(Feline calicivirus,FCV),为研究FCV的生物学特性及流行分布提供理论依据。【方法】从广东省江门市采集的11份疑似患猫的病料中,以RT-PCR筛选含有FCV的病料,利用F81细胞及病毒空斑纯化试验对其进行纯化和扩繁。电镜下观察纯净化分离病毒的形态。通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)测定病毒的半数组织培养感染剂量(median tissue culture infectious dose,TCID₅₀)及不同收毒时间的病毒滴度,绘制分离病毒的一步生长曲线。对分离病毒全基因序列进行核苷酸序列测定,并对其遗传进化及相似性进行分析。【结果】从疑似患猫的粪便病料中分离获得1株FCV,经空斑纯化后,该毒株会导致F81细胞发生皱缩、变圆、葡萄串样聚集和脱落等细胞病变效应。在电镜下病毒粒子呈圆形、直径35~39 nm、无囊膜。IFA结果显示,分离病毒可与兔源FCV VP1-F蛋白特异性多克隆抗体发生结合,在荧光显微镜下可见明显特异性荧光,病毒滴度为1×10⁹ TCID₅₀/mL。分离病毒基因组全长为7 722 bp,与FCV-SH毒株核苷酸相似性最高,为83.94%,属于同一分支。VP1基因与FCV-SH1902毒株核苷酸相似性最高,为81.32%,与FCV-SH1901毒株氨基酸相似性最高,为89.99%。【结论】本研究成功分离到1株FCV,并对其全基因序列进行分析。该研究为FCV致病机理及疫苗研究奠定了基础。

【目的】探究枸杞多糖(LBP)对雷公藤甲素诱导的雄性小鼠生殖损伤的恢复及治疗作用,为雷公藤甲素引起的生殖损伤提供临床基础治疗,为雷公藤甲素的广泛应用提供抗毒配伍药物。【方法】选取45只SPF级4周龄雄性ICR小鼠,采用数字法随机均分为5组:对照组(CON)、雷公藤甲素损伤组(TP)及枸杞多糖低(LBP-L)、中(LBP-M)、高(LBP-H)剂量组。小鼠除对照组腹腔注射生理盐水外,其余各组均腹腔注射120 μg/kg雷公藤甲素,每天1次;2 h后,对照组和雷公藤甲素损伤组灌胃蒸馏水,枸杞多糖低、中、高剂量组分别灌胃20、40和60 mg/kg枸杞多糖溶液,连续14 d后处死采样。利用精液分析仪检测精液质量,HE染色观察小鼠睾丸组织细胞病理变化;利用试剂盒检测小鼠睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)、血清睾酮(T)含量;采用Western blotting检测小鼠睾丸组织B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Cl-半胱氨酸蛋白酶-3(Cl-Caspase3)蛋白的表达情况。【结果】与对照组相比,雷公藤甲素损伤组小鼠体重增长率、脏器系数、精子数目、精子活率、SOD和GSH-Px活性均极显著下降(P＜0.01);精子畸形率和MDA含量均极显著上升(P＜0.01);睾丸组织病理学检测中生精细胞萎缩、精子细胞减少、细胞层次紊乱和空泡化结构严重。与雷公藤甲素损伤组相比,各剂量枸杞多糖组小鼠除血清睾酮外其余指标均有所改善(P＜0.05;P＜0.01),且枸杞多糖高剂量组改善效果最优。Western blotting结果表明,与对照组相比,枸杞多糖高剂量组小鼠睾丸组织中凋亡蛋白表达量显著或极显著升高(P＜0.05;P＜0.01);与雷公藤甲素损伤组相比,枸杞多糖高剂量组小鼠睾丸组织中Bax、Cl-Caspase3蛋白表达量和Bax/Bcl-2比值显著或极显著降低(P＜0.05;P＜0.01);Bcl-2蛋白表达量极显著升高(P＜0.01)。【结论】枸杞多糖对雷公藤甲素造成的生殖损伤有一定的治疗作用,其治疗作用主要体现在增加生物体抗氧化应激水平,提高精子质量,缓解小鼠睾丸组织空泡状细胞和改善细胞紊乱,通过调节相关凋亡蛋白表达抑制睾丸细胞的凋亡。

【目的】利用布鲁氏菌GFP-M5侵染小鼠骨髓源性树突细胞(DCs),比较侵染后细胞的两种处理方法对免疫多肽组分析的影响,建立布鲁氏菌侵染髓系DCs后免疫多肽组分离纯化技术。【方法】使用重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与重组小鼠白介素4(IL-4)诱导培养小鼠骨髓细胞向DCs分化及增殖;然后用布鲁氏菌GFP-M5菌株侵染小鼠骨髓源性DCs后通过扫描电子显微镜观察侵染前后细胞表面形态变化。同时,利用两种方法处理布鲁氏菌侵染后的DCs:①试剂盒法:用Mem-PER^TM Plus试剂盒提取DCs表面抗原肽-主要组织相容性复合体Ⅱ(pMHCⅡ)复合物及其他膜蛋白组分,BCA法测定蛋白浓度;②低渗溶胀法:低渗缓冲液处理侵染后的细胞,计算不同离心力下的除菌率,通过倒置显微镜观察不同离心力下细胞膜碎片悬浮液中细胞膜的损耗程度,收集含pMCHⅡ复合物的细胞膜碎片悬浮液。通过免疫共沉淀(Co-IP)试验以及液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS/MS)分析,识别并筛选MHCⅡ结合的属于布鲁氏菌的肽段,并对两种处理方法获得的细胞膜蛋白组分中筛选出的肽段进行比较。【结果】扫描电镜观察用GFP-M5菌株侵染DCs后,细胞形态发生明显变化,附着在细胞表面的布鲁氏菌多集中在细胞表面的分支处,呈杆状。Mem-PER^TM Plus试剂盒提取2.5×10⁷个细胞的膜蛋白,蛋白浓度为1.4918 mg/mL;共筛选出7个与MHCⅡ分子结合的布鲁氏菌的肽序列。在低渗缓冲液∶细胞悬液1∶20,3 000 r/min离心10 min的条件下,可以达到较高的除菌率(91.00%),同时细胞膜损耗较小;分离出的细胞膜共筛选出289个与MHCⅡ分子结合的布鲁氏菌的肽序列。【结论】试剂盒法处理所耗时间较短,后续试验处理较简便,但提取的膜蛋白样品中筛选出的MHCⅡ分子结合的肽序列较少;低渗溶胀法步骤比较简单易懂,所用试剂较少,处理的细胞膜碎片悬液中筛选出的MHCⅡ分子结合的肽序列较多,但处理过程中会导致部分pMHC复合物的丢失。本试验为布鲁氏菌新型疫苗的研发奠定基础。

【目的】了解广东部分地区猪场疑似猪链球菌病的病原血清型、毒力基因特点、耐药性以及致病性。【方法】对4个疑似流行猪链球菌的猪场的送检病料进行细菌分离培养,采用形态学观察、革兰氏染色镜检、16S rRNA测序以及生化试验鉴定分离菌株,通过PCR试验对分离株进行血清型鉴定、毒力基因检测,采用药敏纸片扩散法对分离菌株进行药敏试验,通过活菌计数法绘制生长曲线,通过人工感染昆明小鼠评价各分离菌对小鼠的致病性。【结果】分离株在10%成牛血清的TSA培养基上长出圆形、灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐的小菌落。镜检出革兰氏阳性球菌,短链状排列,生化特性与猪链球菌相符,测序分析后确定为猪链球菌。血清型鉴定结果显示,4株分离菌均为2型猪链球菌,其中有3株的表型为mrp⁺/epf⁺/orf2⁺/gapdh⁺/sly⁺/fbps⁺/gdh⁺,有1株表型为mrp^-/epf^-/orf2^-/gapdh⁺/sly⁺/fbps⁺/gdh⁺,共2种毒力基因表型。药敏结果显示,4株分离菌对红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明耐药,对青霉素、氨苄西林敏感。分离菌在4~6 h期间达到生长对数期,培养6 h到达活菌峰值。试验组小鼠在感染猪链球菌后出现精神沉郁、抱团、呼吸急促、尾部发青等症状,随后出现死亡,剖检有不同程度的病理变化。4株菌株半数致死量分别为4.47×10⁷、3.57×10⁷、5.77×10⁷、1.22×10⁸ CFU。【结论】本研究成功分离鉴定出4株2型猪链球菌,4株分离株具有多重耐药性且具有较强的致病力。本研究结果可为广东地区猪链球菌的防控以及疫苗候选株的筛选提供理论参考。

【目的】制备猪源A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗,有效控制巴氏杆菌病的发生和流行。【方法】从发病猪病料中分离猪源A型多杀性巴氏杆菌,测定生长曲线,通过小鼠致病性试验筛选疫苗候选菌株。将筛选得到的疫苗候选菌株培养后进行灭活,无菌检验合格后,按1∶4的比例与SUMMIT-CB-200佐剂混合,制备猪源A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗。最后通过小鼠和仔猪免疫攻毒保护试验评估疫苗保护力。【结果】分离到11株猪源A型多杀性巴氏杆菌;生长曲线测定结果显示,11株菌均在培养至6 h时达到生长稳定期,活菌数范围为2.1×10⁹~8.4×10⁹ CFU/mL;小鼠致病性试验结果显示,攻毒后小鼠出现精神沉郁、食欲降低、行动迟缓、被毛粗糙、扎堆、眼睛周围大量脓性分泌物、腹式呼吸、共济失调等症状,共筛选到A4、A8、A9和A11 4株疫苗候选菌株,其中最强毒株A4小鼠皮下攻毒半数致死量(LD₅₀)为167 CFU;仔猪毒力试验结果显示,攻毒后仔猪出现精神沉郁、食欲降低、皮肤发红、呕吐、呼吸困难、腹式呼吸、体温升高、关节肿大、跛行等症状,A4菌株仔猪皮下攻毒LD₅₀为1.72×10¹⁰ CFU;免疫攻毒保护试验结果显示,4株猪源A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗对小鼠和仔猪均具有一定保护力,其中A9保护力最强,对小鼠保护率达60%,对仔猪保护率达75%。【结论】本研究制备的灭活疫苗能对猪源A型多杀性巴氏杆菌强毒株提供较好的免疫保护力,具有一定的开发价值。

【目的】获得能特异性识别大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV双抗夹心法胶体金试纸条的研制提供材料。【方法】根据GenBank上MSRV G蛋白的基因序列(GenBank登录号:OK272491.1)设计扩增其胞外区的特异性引物,以感染MSRV的GS细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增获得目的序列,双酶切后连接至pET-28a(+)表达载体构建重组质粒pET-28a-ΔG,将重组质粒转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞。挑取测序正确的阳性克隆提取重组表达质粒pET-28a-ΔG,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,再次挑取阳性克隆,测序正确后用IPTG诱导表达。目的蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫BALB/c雌性小鼠,4次免疫后眼眶采血获得抗MSRV G蛋白的多克隆抗体,最后通过ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR结果显示,获得大小为1 323 bp的目的条带。SDS-PAGE结果显示,构建的重组表达质粒可高效表达目的蛋白,Ni柱纯化后获得单一目的蛋白,分子质量在48.5 ku左右,与预期相符,且纯度符合免疫原要求。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别不同批次的MSRV G蛋白。IFA结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别天然状态下的G蛋白。【结论】本研究利用MSRV G蛋白的胞外区重组蛋白成功制备出能特异性识别MSRV G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV的免疫检测和疫苗开发奠定了基础。

【目的】研究1株唾液乳杆菌的抑菌物质和益生作用,探讨其在生产中应用的可能性。【方法】经真空冷冻唾液乳杆菌发酵液制得无细胞上清液(cell free supernatant,CFS),采用牛津杯法观察其体外抑菌效果,并通过改变pH、添加过氧化氢酶和多种蛋白酶的方法分析其抑菌物质;将20只SPF昆明小鼠随机分为对照组和唾液乳杆菌组2组,用于研究唾液乳杆菌的安全性和益生作用。【结果】CFS在体外对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显抑制作用;当CSF的pH为5.0时,抑菌活性消失,除胃蛋白酶外,CSF经过氧化氢酶和其他多种蛋白酶处理后,其抑菌活性与未处理的CSF相比均显著或极显著降低(P＜0.05;P＜0.01),表明抑菌物质含有有机酸、过氧化氢和蛋白类物质;唾液乳杆菌组小鼠成活率为100%,且十二指肠绒毛形态明显优于对照组,肝脏指数、脾脏指数和空肠Occludin基因mRNA的表达量均与对照组差异不显著(P＞0.05),而体重和空肠Claudin-2基因mRNA表达量极显著高于对照组(P＜0.01)。【结论】该唾液乳杆菌在体外有较强的抑菌能力且对小鼠益生作用良好,抑菌物质包含有机酸、过氧化氢和蛋白类物质,有作为动物微生态制剂开发的潜力。

【目的】探明鸡源环指蛋白165(ring finger protein 165,RNF165)在A亚群禽白血病病毒(ALV-A)复制中的作用,为进一步研究鸡源RNF165对ALV-A致病性的影响提供参考。【方法】将ALV-A接种于DF-1细胞和1日龄雏鸡,通过Western blotting和实时荧光定量PCR方法分别从体外和体内两个方面验证ALV-A对宿主RNF165表达的影响;参考已公布的RNF165基因序列设计过表达引物,通过PCR扩增RNF165基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1;将验证表达的重组质粒转染DF-1细胞,1 d后接种ALV-A,使用Western blotting检测过表达RNF165对病毒复制的影响;最后设计突变引物,构建RNF165功能结构域突变质粒,将过表达质粒和突变质粒分别转染DF-1细胞,1 d后接种ALV-A,Western blotting测定gp85蛋白表达差异。【结果】ALV-A感染DF-1细胞后未能检测到内源性的RNF165蛋白,但基因转录水平较对照组明显下调(P＜0.01)。在体内试验中,与对照组相比,感染病毒雏鸡肝脏中RNF165基因和蛋白表达水平均有所下调(P＜0.01);通过PCR成功扩增到大小为1 068 bp的目的片段并成功克隆至pcDNA3.1,Western blotting结果显示,在39 ku处出现目的条带,RNF165过表达后促进了病毒复制;测序结果显示,成功构建出功能结构域突变质粒,与过表达质粒组相比,RNF165突变质粒组病毒的复制水平受到显著抑制。【结论】ALV-A感染抑制DF-1细胞和雏鸡肝脏RNF165的表达,在体外试验中,过表达RNF165会促进ALV-A的复制,且这种影响与其保守结构域有关。

【目的】制备猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)灭活病毒包被的微胶囊,并评价其对新生仔猪口服黏膜免疫效果,以预防TGEV引起严重腹泻和造成经济损失。【方法】采用一步法以海藻酸钠和壳聚糖为微胶囊壁材,以灭活的TGEV为抗原制备TGEV微胶囊疫苗。以包封率、蛋白载量、体外释放速率为微胶囊质量评价指标,分别从成囊材料的配比及不同盐水溶液对微胶囊性能的影响方面对TGEV微胶囊的制备进行筛选,并评价TGEV微胶囊在不同环境的释放速率和室温储存耐受性。最后进行免疫学分析,对仔猪进行口服免疫,测定各项免疫指标,开展抗体效价检测和病毒中和试验。【结果】筛选出的制备微胶囊的最佳工艺条件为:海藻酸钠浓度1.5%,壳聚糖浓度1.2%,氯化钙浓度3.5%,灭活病毒抗原加入量为1~2 mL,在此工艺条件下制备的TGEV微胶囊在PBS和盐水溶液中第3天释放率均超过50%;第18天,释放率分别达到97%和88%。常温放置5个月最低释放率仍保持在80%以上。口服免疫仔猪,微胶囊高、低剂量组粪便样品中IgA抗体的D_{490 nm}值分别为0.97和1.49,IgG的抗体的D_{490 nm}值分别为1.03和1.75。病毒中和试验中,微胶囊高、低剂量组抗体IgG的病毒50%中和效价分别为1∶512和1∶256;微胶囊高、低剂量组抗体IgA的病毒50%中和效价分别为1∶128和1∶64。【结论】海藻酸钠-壳聚糖微胶囊不仅具有在肠道中释放灭活的TGEV抗原的缓释效果,且对于疫苗免疫具有佐剂辅助效果,可增加适应性黏膜免疫应答中的抗体效价,在肠道中释放灭活的TGEV可有效刺激黏膜和全身免疫反应。

【目的】对单增李斯特菌IspD蛋白的潜在生物学功能进行预测分析,并表达纯化IspD蛋白,为后续IspD蛋白的研究提供理论支撑。【方法】从NCBI中获得单增李斯特菌IspD的编码序列(基因ID:986270)和氨基酸序列(登录号:NP_464611.1),运用生物信息学软件对IspD蛋白编码序列进行开放阅读框分析,对氨基酸序列进行基本特性、空间结构、抗原表位、修饰化位点、蛋白互作及相似性等预测分析。对IspD蛋白编码序列进行密码子优化并合成,采用无缝克隆法构建重组质粒pET-32a-IspD并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将测序和双酶切验证正确的阳性克隆经IPTG低温过夜诱导表达,采用镍柱亲和层析法纯化得到IspD融合蛋白,利用SDS-PAGE和Western blotting验证IspD融合蛋白表达、纯化及反应原性。【结果】IspD蛋白编码基因为lmo1086,全长711 bp,共有4个开放阅读框,其中ORF1为最长的开放阅读框,可编码236个氨基酸。氨基酸序列分析显示,IspD蛋白无跨膜结构域、信号肽,是一种亲水性蛋白,亚细胞定位于细胞质中,为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷酰基转移酶。α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲参与了IspD蛋白二级结构的组成,三级结构模型预测与二级结构特点相符。IspD蛋白具有多个T、B细胞抗原表位、固定无序结构域、磷酸化、糖基化、甲基化及乙酰化修饰位点。蛋白互作分析显示,IspD蛋白与DXR、IspF、ipk等多个蛋白存在相互作用,IspD与其相互作用最强的DXR蛋白之间通过氢键、盐桥等实现连接和相互作用。试验成功构建了表达菌株pET-32a-IspD,SDS-PAGE结果显示,在上清中高表达IspD融合蛋白;Western blotting验证显示,纯化的IspD融合蛋白具有反应原性。【结论】IspD蛋白具有成为候选诊断、疫苗研发和药物靶点等的潜在价值。试验表达纯化得到IspD融合蛋白,可为后续IspD蛋白具体功能的研究提供理论依据。

【目的】了解内蒙古地区犊牛腹泻大肠杆菌的耐药性及毒力基因携带情况,筛选敏感抗菌药物,指导临床上治疗犊牛腹泻合理用药。【方法】对采集到的犊牛腹泻病料进行大肠杆菌分离纯化、生化鉴定及分子生物学鉴定,采用药敏试验确定分离菌株的耐药表型及多重耐药情况,并对其进行耐药基因及毒力基因检测。【结果】分离菌株在伊红-美蓝培养基上呈紫黑色带有绿色金属光泽的菌落;与靛基质、甲基红和麦芽糖等反应阳性,柠檬酸盐、H₂S等反应阴性。PCR扩增出大小为262 bp的大肠杆菌特异性基因uida目的条带。经分离鉴定从44份病料中共得到32株犊牛腹泻大肠杆菌,分离率为72.7%。药敏试验结果显示,犊牛腹泻大肠杆菌呈现多重耐药,耐3种及3种以上抗菌药物的占比达到了84.4%;其中,对氨苄西林、头孢噻肟、环丙沙星、卡那霉素和复方新诺明耐药明显,对头孢吡肟、头孢西丁、多西环素、米诺环素和加替沙星相对敏感,尤其对美罗培南和多黏菌素B敏感。耐药基因中检出β-内酰胺类基因bla_TEM、bla_CTX-M,喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrS,四环素类耐药基因tetA、tetB、tetD和氨基糖苷类耐药基因aadA、aadB、aacC、aac(3')Ⅱa,其中aadA和bla_CTX-M基因检出率最高,分别为100%和87.5%。在对10种毒力基因检测中,只检测到了Irp2、FyuA、astA、LT-Ⅱ和HlyA 5种毒力基因,而Sta、Stb、HlyE、Stx1和Stx2e 毒力基因未被检测到。【结论】内蒙古地区犊牛腹泻大肠杆菌多重耐药现象较严重,携带bla_CTX-M和aadA等多种耐药基因,携带Irp2和FyuA等毒力基因,建议临床上根据药敏试验结果科学合理地选择抗菌药物,有效做好疫病防控。

【目的】2022年12月西藏拉萨市某县藏羊陆续出现不明原因死亡病例,试验旨在确定引起西藏拉萨藏羊死亡的病原,研究其生物学特性,为今后对该病的防控提供科学依据。【方法】从病死藏羊病料中分离培养、纯化病原菌,通过形态特征、生化特性、16S rRNA PCR扩增及遗传进化分析对分离菌株进行鉴定;通过动物致病性试验、药物敏感性试验对分离菌株的致病性、耐药性进行研究。【结果】从病死藏羊病料组织中分离到8株革兰阳性球菌,分别命名为:Tibet-1、Tibet-2、Tibet-3、Tibet-4、Tibet-5、Tibet-6、Tibet-7、Tibet-8。生化鉴定结果显示,分离菌株均能发酵麦芽糖、乳糖、葡萄糖、山梨醇、七叶苷及水杨苷,能分解甘露醇,不能分解尿素酶、淀粉、木糖,V-P试验为阴性,结果符合链球菌的生化特性。16S rRNA基因测序结果显示,8株分离菌株与链球菌新亚种羊属链球菌亚种(Streptococcus ovis)标准株CCUG 39485T(Y17358)的相似性为95.8%~97.4%。系统进化树显示,分离菌株与羊属链球菌亚种处于同一支,而与链球菌其他种属处于不同分支。动物致病性试验表明,分离菌株对小鼠具有不同强度的致病性,死亡小鼠肝脏、肺脏等内脏器官有明显病变。药物敏感性试验结果显示,分离菌株对氯霉素、氧氟沙星、环丙沙星敏感,对头孢拉定、万古霉素、克林霉素等13种抗菌药存在不同程度的耐药性,其中7株分离菌株存在多重耐药性。【结论】本研究成功分离到8株藏羊源致病性羊属链球菌,不同分离菌株耐药性存在一定差异,可为临床用药和防控提供参考依据。

【目的】研究小分子多肽LK-5(氨基酸序列为LHMFK)对CCl₄致急性肝损伤模型小鼠的保护作用,探讨其作用机制。【方法】72只小鼠随机分为正常组、模型组、联苯双酯组(150 mg/kg)及LK-5低、中、高剂量组(30、60、120 mg/kg),每组12只。连续给药10 d,1 次/d,每次10 mL/kg。末次给药2 h后,各组(除正常组外)腹腔注射0.1% CCl₄花生油溶液,建立CCl₄致小鼠急性肝损伤模型,16 h后,按照试剂盒方法,检测小鼠血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆汁酸(TBA)和碱性磷酸酶(AKP)水平,检测肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10、血管紧张素1-7(Ang 1-7)和血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)水平。制作肝脏病理组织切片,苏木精-伊红染色(HE)后观察肝脏组织病理学变化。【结果】与正常组比较,模型组小鼠肝细胞有明显的脂肪变性,炎细胞分散分布于肝小叶血管周围和肝实质内,血清ALT、AST、AKP活性和TBA水平均显著上升,肝组织SOD、GSH-Px活性显著下降,MDA水平显著上升(P＜0.05),说明成功建立急性肝损伤模型,TNF-α、IL-6、Ang Ⅱ水平显著升高(P＜0.05)。与模型组比较,LK-5中、高剂量组能够显著降低血清ALT、AST活性(P＜0.05),各剂量组均可降低血清TBA水平和AKP活性(P＜0.05),LK-5高剂量组能够显著提高小鼠肝组织SOD、GSH-Px活性(P＜0.05),LK-5中、高剂量组能够显著降低肝组织MDA水平(P＜0.05),LK-5高剂量组TNF-α水平显著降低(P＜0.05),各剂量组能够显著降低肝组织IL-6、Ang Ⅱ水平(P＜0.05)。病理切片结果显示,LK-5各剂量组炎细胞均有不同程度减少,LK-5高剂量组肝小叶血管周围和肝实质内无炎细胞浸润。【结论】LK-5各剂量组对CCl₄致急性肝损伤小鼠具有保护作用,其中60、120 mg/kg LK-5效果更为明显,其作用机制可能与抗氧化、抗炎及对肾素-血管紧张素系统(RAS)的调控有关。

【目的】通过网络药理学和分子对接技术对蒲公英、连翘和金银花组成的中药复方进行分析及预测,探究该复方在防治奶牛乳房炎中的作用。【方法】通过TCMSP和Herb数据库对中药复方蒲公英、连翘和金银花主要活性成分及相关靶点进行挖掘,于GeneCards和DisGeNET数据库查找奶牛乳房炎的相关靶点取交集,得到该中药复方防治奶牛乳房炎的关键靶点,并构建蛋白互作(PPI)网络;通过DAVID数据库对核心靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析;通过AutoDock软件进行分子对接,并运用PyMOL对分子结果进行可视化处理。【结果】中药复方的有效活性成分主要包括山奈酚、七叶苷原、槲皮素、香豆素等,这些药物成分主要作用靶点370个,奶牛乳房炎的相关靶点216个。该中药复方防治奶牛乳房炎有32个预测靶点,主要包括白细胞介素6(IL6)、趋化因子8(CXCL8)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤抑制基因(TP53)和Toll样受体4(TLR4)等。对上述32个靶点进行富集分析发现与正向调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录和正向调控IL10产生等生物过程,细胞核、细胞质、细胞外间隙等细胞组分,细胞因子活性、生长因子活性和受体连接等分子功能,以及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路(P13K-Akt)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)和癌症等通路相关。分子对接结果表明,该中药复方主要活性成分山奈酚和槲皮素均与关键靶点CXCL8和EGFR具有良好的结合活性。【结论】由蒲公英、连翘和金银花组成的中药复方可通过多成分、多靶点和多通路共同防治奶牛乳房炎。本研究为兽医临床应用该中药复方治疗奶牛乳腺炎提供了理论依据。

【目的】构建单增李斯特菌双组分系统resE/resD基因缺失株,并探究其抗渗透压应激能力及致病性。【方法】利用同源重组方法构建单增李斯特菌双组分系统resE/resD基因缺失株,通过不同环境生长曲线比较分析单增李斯特菌野生株10403S与缺失株ΔresE/resD的生存性能差异;通过应激存活试验探究resE/resD基因缺失对单增李斯特菌抗渗透压能力的影响;通过对结肠癌细胞Caco-2及胃腺癌细胞MGC803进行细胞黏附、侵袭试验以及小鼠毒力试验,评估resE/resD基因缺失对单增李斯特菌细胞黏附与侵袭能力及小鼠致病性的影响。【结果】生长曲线结果显示,resE/resD基因缺失不影响单增李斯特菌正常生长,在5% NaCl条件下缺失株ΔresE/resD生长能力弱于野生株10403S,平台期抗渗透压应激能力显著降低(P＜0.05)。应激存活试验结果表明,在10% NaCl条件下应激处理1 h后,缺失株ΔresE/resD存活率极显著低于野生株10403S(P＜0.01)。Caco-2及MGC803细胞侵袭试验结果显示,缺失株ΔresE/resD对细胞黏附能力显著减弱(P＜0.05),且细胞侵袭能力极显著降低(P＜0.01)。小鼠毒力试验结果显示,缺失株ΔresE/resD小鼠脾脏与肝脏中细菌载量极显著或显著低于野生株10403S(P＜0.01;P＜0.05)。【结论】双组分系统resE/resD基因缺失不影响单增李斯特菌野生株10403S正常生长,但缺失株ΔresE/resD表现出抗渗透压应激能力下降,且减弱了单增李斯特菌对细胞黏附侵袭力和小鼠致病性。

【目的】研究二丁提取散的抗炎、镇痛和解热作用。【方法】利用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、冰醋酸致小鼠扭体、脂多糖(LPS)致家兔发热法来研究二丁提取散的抗炎、镇痛和解热作用。试验小鼠随机分为5组,每组10只,分别为二丁提取散低、中、高剂量组,阳性对照组(蒲地蓝组/阿司匹林组)和模型对照组。二丁提取散低、中、高剂量组及蒲地蓝组每日分别以含生药3.9、7.8、15.6和4.8 g/kg的剂量灌胃给药1次,连续给药4 d,阿司匹林组于第4天灌胃0.2 g/kg阿司匹林,模型对照组灌服等量纯化水,给药结束后按照不同试验具体操作。家兔经耳缘静脉注射0.3 mL/kg LPS溶液(2 μg/mL)构建LPS致热模型,将满足试验要求的家兔随机分为5组,其中二丁提取散低、中、高剂量组以及阿司匹林组分别以含生药1.4、2.8、5.6和0.1 g/kg剂量灌胃给药,模型对照组灌服等量纯化水,分别于给药后1、2、3、4、5、6 h测量家兔体温变化情况。【结果】二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验结果显示,与模型对照组相比,二丁提取散高、中剂量组小鼠耳廓肿胀程度极显著或显著降低(P＜0.01;P＜0.05);与蒲地蓝组相比,二丁提取散各剂量组差异不显著(P＞0.05)。冰醋酸致小鼠扭体试验结果显示,与模型对照组相比,二丁提取散高、中剂量组小鼠扭体数极显著或显著减少(P＜0.01;P＜0.05);与阿司匹林组相比,二丁提取散高剂量组差异不显著(P＞0.05),中、低剂量组小鼠扭体数显著或极显著增加(P＜0.05;P＜0.01)。LPS致家兔发热试验结果显示,与模型对照组相比,给药后2 h,阿司匹林组及二丁提取散高、中剂量组家兔体温极显著或显著降低(P＜0.01;P＜0.05);与阿司匹林组相比,给药后2 h,二丁提取散中剂量组家兔体温显著升高(P＜0.05)。【结论】二丁提取散具有一定的抗炎、镇痛和解热作用,研究结果为二丁提取散的临床应用及进一步研究提供理论依据。