【目的】试验旨在利用全基因组关联分析(GWAS)鉴定影响鸭胸肌矿物元素含量的候选基因及分子标记,解析矿物元素性状的遗传机制。【方法】研究构建了北京鸭×野鸭F2代资源群体,利用个体血液样本进行全基因组重测序,采集8周鸭胸肌并根据国标方法测定7种常量矿物元素含量,结合重测序数据与矿物元素表型数据进行全基因关联分析,鉴定影响矿物元素含量相关基因。【结果】7种矿物元素的表型遗传力分别为磷(0.007)＜铁(0.100)＜镁(0.120)＜钠(0.140)＜钾(0.150)＜钙(0.190)＜锌(0.350)。相关性分析结果表明,镁和钾元素相关性最高(r=0.62),磷与镁、钾元素在鸭胸肌中的含量呈现较高的正相关,r值分别为0.43和0.56。通过GWAS鉴定出与锌元素含量显著相关的1个SNP位点在6号染色体12 075 283 bp处达到全基因组水平上的显著关联(-log₁₀P-value=8.03),与最高点SNP高度相关的39个SNPs将候选区间缩小至39 kb,该区间内仅存在1个基因SORCS3,结合基因功能注释与转录组分析确定SORCS3为锌元素含量变异的候选基因。与磷元素含量表型数据在全基因组水平上达到显著相关的最高点SNP与260个SNPs高度相关(R²＞0.4),均位于4号染色体17.1—18.6 Mb之间,且包含27个基因。结合相关性分析、基因功能注释及转录组分析,最终确定6个与磷元素含量高度相关的候选基因:TUSC3、MICU3、LOC101803915、MTMR7、SLC7A2和ASAH1。【结论】本研究利用全基因组关联分析鉴定出鸭胸肌锌元素含量候选基因SORCS3,同时结合转录组分析鉴定出与磷元素含量相关的6个候选基因。结果丰富了禽肉矿物营养的知识体系,为培育优良畜禽产品提供了重要的理论基础。

【目的】探究白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)基因在白羽番鸭中的生物学功能,阐明其在下丘脑、垂体、卵巢、输卵管膨大部、子宫组织中的表达模式。【方法】以白羽番鸭卵巢组织为研究对象,采用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆白羽番鸭LIF基因序列,并进行相似性比对和系统进化树构建;通过生物信息学方法分析LIF蛋白理化性质及结构。利用实时荧光定量PCR技术检测LIF基因在白羽番鸭下丘脑、垂体、卵巢、输卵管膨大部、子宫5个组织中的相对表达量。【结果】克隆得到白羽番鸭LIF基因序列长1820 bp,其中CDS区长636 bp,编码211个氨基酸。核苷酸序列相似性比对结果表明,白羽番鸭LIF基因序列与凤头潜鸭、绿头鸭、棕硬尾鸭、黑天鹅、金丝雀、鹌鹑、鸡、山雀的相似性分别为99.36%、99.21%、99.21%、98.11%、92.03%、90.68%、90.58%和87.60%。系统进化树分析表明,白羽番鸭与凤头潜鸭的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。白羽番鸭LIF蛋白是碱性亲水的稳定蛋白,有16个磷酸化位点、7个N-糖基化位点及1个信号肽,主要定位于细胞外和溶酶体;LIF蛋白质二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,蛋白质三级结构预测结果与二级结构一致。白羽番鸭LIF蛋白可能与IL6ST、CNTFR、IL6、OSMR、LIFR、IL6R、STAT3、CNTF、IFNGR1、IFNGR2蛋白具有相互作用。组织表达图谱显示,LIF基因在白羽番鸭5种组织中均有表达,其中就巢期白羽番鸭LIF基因表达量在输卵管膨大部、卵巢组织显著高于产蛋期(P＜0.05);两个时期LIF基因在输卵管膨大部的表达量均最高,且显著高于其他组织(P＜0.05)。【结论】试验成功克隆了白羽番鸭LIF基因,其在输卵管膨大部的表达量显著高于其他组织,且就巢期表达量高于产蛋期。结果为探究白羽番鸭卵巢发育的调控机制提供理论依据。

【目的】试验旨在对美洲水貂(Neovison vison)褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine,MT)合成的限速酶5-羟色胺-N-乙酰基转移酶(aralkylamine N-acetyltransferase,AANAT)基因进行克隆和生物信息学分析,为探究AANAT基因在水貂中的生物学功能提供参考。【方法】对水貂尾静脉采血后提取DNA,利用同源重组的方法克隆AANAT基因并分析其编码区(CDS)序列,推导成氨基酸序列后进行相似性比对及系统进化树构建,并对AANAT蛋白进行生物信息学分析。【结果】水貂AANAT基因序列长约1631 bp,CDS区长504 bp,可编码167个氨基酸。水貂AANAT氨基酸序列与雪貂相似性最高(98.2%),系统进化树分析也显示其与雪貂亲缘关系最近。生物信息学分析结果表明,水貂AANAT蛋白为疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,主要分布于细胞质中,有5个抗原结合位点为非分泌型蛋白,该蛋白含有多个磷酸化、糖基化等翻译后修饰位点。AANAT蛋白含有1个保守的N-酰基转移酶超家族结构域,该家族与哺乳动物的昼夜节律密切相关。AANAT蛋白二级结构以无规则卷曲为主,三级结构含有多个保守的催化残基。蛋白互作网络分析表明,AANAT蛋白可与多个5-羟色胺合成相关的蛋白相互作用。【结论】试验成功获得水貂AANAT基因序列,AANAT蛋白结构和特异性修饰位点可能通过定位乙酰辅酶A和5-羟色胺参与调控MT的生物合成,结果可为AANAT基因对水貂胚胎滞育的调控机制及提高繁殖力等研究提供参考。

【目的】了解广西沿海地区水禽H3亚型禽流感病毒的基因组分子特征。【方法】本研究通过RT-PCR一步法分段扩增法,对2020年从广西沿海地区分离到的2株海鸭源H3亚型禽流感病毒A/duck/Guangxi/S11359/2020(H3N1)与A/duck/Guangxi/S11374/2020(H3N8)进行全基因组测序与进化分析。【结果】2株H3亚型禽流感病毒的HA蛋白裂解位点序列均为³⁴⁰PEKQTR↓GLFG³⁴⁹,为低致病性禽流感病毒的分子特征,与受体嗜性关联的第226、228位氨基酸均为Q和T,可能仍主要结合禽类受体;BLAST分析结果显示,本研究H3N1亚型禽流感病毒的M、NP基因及H3N8亚型禽流感病毒的PA基因,与H7亚型禽流感病毒相似性最高,分别为99.5%、98.7%和98.9%,表明H3可能与H7亚型禽流感病毒发生了基因交换;2株H3亚型禽流感病毒与越南、孟加拉国、韩国等周边国家水禽源的H3、H4、H6、H7、H9等亚型相似性较高,可能拥有相同的进化来源;遗传进化分析表明,H3亚型禽流感病毒各基因进化分支均属于欧亚谱系,与水禽源毒株遗传距离较近,犬源、猫源的毒株次之,人源、猪源的毒株较远,但H3N1亚型禽流感病毒的NS基因与日本早期人源流感毒株A/Aichi/2/1968遗传关系最近,可能发生了基因置换。H3N8亚型禽流感病毒的HA基因检测有重组信号,重组的亲本毒株分别为A/duck/Beijing/40/04(相似性为93.1%)和A/canine/Beijing/20121215-34/2012(相似性为97.1%)。【结论】广西沿海地区的2株H3亚型禽流感病毒基因来源复杂,表现出遗传多样性特征。

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)的一种新发蚊媒病毒,其引起的疫病在临床上以蛋鸭产蛋量下降和雏鸭神经系统损伤为特征,给国内养鸭业造成了重大的经济损失。DTMUV感染自2010年在上海市暴发后,逐渐向中国东部、东南部和北部主要鸭养殖场扩散。目前国内已建立了多种用于DTMUV临床诊断或实验室检测方法。DTMUV的分离鉴定和免疫组化用于检测病毒颗粒的存在;DTMUV的血清学检测方法主要包括间接ELISA、竞争ELISA和胶体金免疫层析条等,可检测DTMUV的特异性蛋白或抗体,广泛应用于DTMUV的现场检测;以常规PCR、多重PCR及CRISPR技术为主的病毒核酸检测方法实现了DTMUV的快速临床诊断,促进了鸭坦布苏病毒病的流行病学调查和致病机制研究。随着部分疫苗的开发和商业化,中国DTMUV感染的流行强度也由暴发逐渐转变为零星散发。但DTMUV的宿主范围较广,传播途径多样且具有潜在的人畜共患性,为及早发现并控制DTMUV的传播,建立快速、准确的检测方法和安全有效的疫苗显得尤为重要。笔者对DTMUV的检测方法和疫苗研发的研究进展进行了综述,以期为DTMUV感染的防控提供参考。

【目的】探究单增李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶ⅡC (EⅡC)对LM关键毒力基因表达的影响。【方法】构建分离株LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC,测定各菌株的生长曲线和对不同糖的发酵情况,测定侵染人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)后的黏附、侵袭和胞内增殖能力,利用实时荧光定量PCR方法检测在脑心浸液(BHI)培养条件下和侵染HCMEC/D3后各菌株毒力基因的转录水平。【结果】成功构建LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC。EⅡC基因的缺失不影响LM928的生长和对葡萄糖、纤维二糖、果糖、鼠李糖、七叶苷和水杨苷的发酵。EⅡC基因缺失后,LM928对HCMEC/D3的侵袭率极显著下降(P＜0.01),黏附能力无显著变化(P＞0.05)。LM928ΔEⅡC胞内增殖菌量在2~4 h时显著低于LM928和CLM928ΔEⅡC(P＜0.05),但在8~12 h时均显著高于LM928和CLM928ΔEⅡC(P＜0.05)。在BHI培养条件下,LM928ΔEⅡC毒力基因hly、prfA、actA、plcB、inlA、inlB、inlC和mpl转录水平极显著下调(P＜0.01),毒力基因plcA转录水平极显著上调(P＜0.01);在侵染HCMEC/D3后,LM928ΔEⅡC毒力基因hly、prfA、inlB、inlC和mpl转录水平相对于LM928和CLM928ΔEⅡC显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),毒力基因plcA和inlA相比于CLM928ΔEⅡC极显著下调(P＜0.01),毒力基因actA和plcB转录水平无显著差异(P＞0.05)。【结论】LIPI-4中EⅡC不参与LM928的生长及其对部分糖的发酵,能调控LM中重要的侵袭相关基因和毒力相关基因。本试验结果为进一步探究EⅡC在LM和LIPI-4中的作用奠定基础。

【目的】克隆大白猪半胱氨酸双加氧酶1(cysteine dioxygenase type 1,CDO1)基因并进行生物信息学分析,检测CDO1基因在大白猪不同组织中的表达情况,并定位CDO1在乳腺中的位置,为进一步探究CDO1基因在乳腺发育过程中的调控作用提供依据。【方法】通过PCR扩增大白猪CDO1基因CDS全长序列,将CDO1基因序列与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取单个阳性菌扩增培养,菌液通过PCR鉴定后测序,对测序结果进行不同物种间序列相似性比对及系统进化树构建;利用在线预测软件对CDO1蛋白进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测CDO1基因在大白猪不同组织中的表达水平;利用免疫组化方法检测CDO1蛋白在母猪乳腺中的定位。【结果】大白猪CDO1基因CDS区序列全长603 bp,编码200个氨基酸,家猪与大白猪CDO1基因核苷酸序列相似性最高。系统进化树结果显示,大白猪与家猪先聚为一类,且与猕猴亲缘关系较近。CDO1蛋白的分子质量为23.018 ku,等电点为5.98,不稳定系数为33.58(＜40),为稳定亲水性蛋白,定位在胞浆内,存在糖基化和磷酸化位点,CDO1蛋白二级结构和三级结构模型预测结果一致。组织表达分析结果显示,CDO1基因在大白猪肝脏中表达量最高,显著高于其他组织(P＜0.05),在乳腺、背最长肌和心脏中表达次之,显著高于除肝脏外的其余组织(P＜0.05),在十二指肠中表达量最低。免疫组化结果显示,CDO1定位在母猪乳腺终端芽(TEB)体细胞、上皮细胞和脂肪细胞中。【结论】大白猪CDO1基因CDS区全长603 bp,编码200个氨基酸,在心脏、肝脏、乳腺中高表达;CDO1蛋白为稳定亲水性蛋白,在母猪乳腺TEB体细胞、上皮细胞和脂肪细胞中富集。研究结果为进一步探究CDO1蛋白调控母猪乳腺发育和影响母猪泌乳功能提供参考。

赖氨酸作为猪饲粮的第一限制性氨基酸,也是构建理想蛋白质模型的关键。赖氨酸能够影响猪的生长性能、养分消化率、机体免疫、肠道健康、体内蛋白质的合成。赖氨酸缺乏或者过量都会对猪各方面产生影响。所以,探究饲粮中赖氨酸添加水平及赖氨酸需要量对猪的生产性能及各项指标的影响极为重要。作者基于国内外近年来对猪赖氨酸相关的研究发现,饲粮赖氨酸水平比推荐量低15%时会诱导炎症。而适量的赖氨酸可增强猪的细胞免疫,进而影响猪肠道健康,促进肠上皮细胞增殖,增强细胞活力,提高猪的养分消化率,并可通过调控卫星细胞促进骨骼肌合成;作者同时总结了仔猪、育肥猪、公猪、母猪以及低蛋白质饲粮条件下赖氨酸的需要量,以期为赖氨酸在动物生产中的合理应用提供科学依据。

【目的】研究饲粮中添加β-胡萝卜素对奶牛泌乳高峰期产奶性能、血常规指标、血清生化与免疫指标的影响。【方法】选用20头体况良好、平均体重为(550.00±32.71) kg、胎次为2~3胎的干奶期中国荷斯坦奶牛,随机分为4组,每组5头。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加600、1200和1800 mg/d β-胡萝卜素,试验从产犊前60 d至产犊后90 d,共150 d。试验期间测定奶牛产奶量、乳成分,试验结束时尾静脉采血,测定血常规,分离血清测定血清生化指标及免疫指标。【结果】与对照组相比,饲粮中添加β-胡萝卜素对奶牛泌乳高峰期产奶量、乳脂率、乳蛋白率和乳糖率影响不显著(P＞0.05),添加600、1200 mg/d β-胡萝卜素显著降低了牛乳中体细胞数(P＜0.05);饲粮中添加β-胡萝卜素对奶牛血液白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白(HGB)和红细胞压积(HCT)均无显著影响(P＞0.05);饲粮中添加1200、1800 mg/d β-胡萝卜素显著提高了奶牛血清甘油三酯(TG)含量(P＜0.05),添加600、1200 mg/d β-胡萝卜素显著提高了血清高密度脂蛋白(HDL)含量(P＜0.05);饲粮中添加600、1800 mg/d β-胡萝卜素显著降低了奶牛血清CD4⁺含量(P＜0.05),添加1200 mg/d β-胡萝卜素显著降低了奶牛血清CD8⁺和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)含量,并显著提高了血清CD4⁺/CD8⁺(P＜0.05)。【结论】饲粮中添加适量β-胡萝卜素可以降低奶牛泌乳高峰期乳中体细胞数和血清炎性细胞因子含量,增强奶牛泌乳高峰期的细胞免疫功能。

【目的】试验旨在探究胍基乙酸(guanidinoacetic acid,GAA)对肉鸡肉品质和腹脂沉积的影响。【方法】选取1日龄科宝肉仔鸡90只,随机分为3组,每组5个重复,每个重复6只鸡。试验Ⅰ组(对照组)饲喂基础饲粮,试验Ⅱ、Ⅲ组分别在基础饲粮中添加1.2和3.6 g/kg GAA。饲养周期为42 d。于42日龄采集胸肌、腿肌、肝脏、腹部脂肪及血液样品,测定肉品质、肌肉病及腹脂沉积相关指标。【结果】与试验Ⅰ组相比,试验Ⅱ、Ⅲ组胸肌和腿肌pH_{45 min}极显著或显著增加(P＜0.01;P＜0.05);试验Ⅱ组胸肌肉色b^*值、腿肌肉色a^*值和失水率均极显著增加(P＜0.01),腿肌肉色L^*值、木质肉与白纹肉发生率均显著降低(P＜0.05);试验Ⅲ组木质肉发生率显著升高(P＜0.05)。试验Ⅱ组腹脂率、腹脂细胞直径均显著低于试验Ⅰ、Ⅲ组(P＜0.05),血清甘油三酯(TG)水平显著高于试验Ⅰ、Ⅲ组(P＜0.05)。【结论】饲粮中添加1.2 g/kg GAA能显著改善肉鸡肌肉品质,减少胸肌木质肉、白纹肉的发生,显著降低腹脂沉积。

【目的】试验以人工胃肠液(artificial gastrointestinal fluid,AGIF)作为反应体系,研制高效的霉菌毒素生物解毒剂,以达到有效降解黄曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁,AFB₁)的目的。【方法】首先考察4种益生菌在人工胃肠液中对AFB₁的降解率,然后使用响应面设计对4种益生菌组合进行优化,制备复合益生菌;其次,将复合益生菌与不同浓度的AFB₁降解酶进行复合,以筛选最佳复合生物解毒剂;最后评估复合生物解毒剂对AFB₁的降解效果。【结果】①枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casein)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和产朊假丝酵母(Candida utilis)在人工胃肠液条件下对AFB₁降解率分别为20.59%、19.97%、28.75%和25.67%;②利用响应面设计对4种益生菌进行优化组合,结果表明4种益生菌配比为1.0×10⁵、1.0×10⁵、1.0×10⁷和1.0×10⁵ CFU/mL时,AFB₁降解率达到最大,为41.5%,显著大于单一益生菌降解率(P＜0.05);③复合益生菌与0.1%的霉菌毒素降解酶配伍合成的复合生物解毒剂,对AFB₁的降解率达到55.28%,显著高于益生菌或霉菌毒素降解酶单独使用的效果(P＜0.05)。【结论】本试验中由益生菌与霉菌毒素降解酶组合形成的复合生物解毒剂可有效降解AFB₁,可为饲料中AFB₁的生物解毒措施提供参考。

【目的】探究硒对铅致小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响。【方法】以小鼠睾丸间质细胞为研究对象,分为对照组、硒组、铅组和硒＋铅组:硒组在细胞培养液中添加2 μmol/L亚硒酸钠;铅组在细胞培养液中添加40 μmol/L醋酸铅;硒＋铅组在细胞培养液中联合添加2 μmol/L亚硒酸钠＋40 μmol/L醋酸铅,体外培养24 h。采用MTT法检测细胞增殖情况;检测细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;使用化学荧光法测定活性氧(ROS)水平;运用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测凋亡相关基因天冬氨酸半胱氨酸酶-3(Caspase3)、Caspase8、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA和蛋白表达水平。【结果】与对照组相比,铅组细胞增殖显著受到抑制(P＜0.05),MDA含量和ROS水平显著上升(P＜0.05),SOD和GSH-Px活性显著下降(P＜0.05),同时,铅显著上调了Caspase3、Caspase8、Bax的mRNA和蛋白表达水平(P＜0.05),显著下调了Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平(P＜0.05);硒组小鼠睾丸间质细胞增殖活性显著提高(P＜0.05)。与铅组相比,硒＋铅组细胞中MDA含量和ROS水平显著下降(P＜0.05),SOD和GSH-Px活性显著升高(P＜0.05),且介于对照组和铅组之间;Caspase3、Caspase8、Bax的mRNA和蛋白表达水平显著下降(P＜0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平则显著上升(P＜0.05),均介于铅组和对照组之间。【结论】铅能抑制小鼠睾丸间质细胞增殖活力,诱导细胞氧化应激和凋亡;补充适量硒可以促进细胞增殖,且通过提高抗氧化酶活性缓解铅造成的细胞氧化应激和凋亡。

【目的】探究鸽促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)基因多态性,筛选影响母鸽产蛋性状的显著单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,用于高产母鸽的早期选择。【方法】本试验以78对白羽王鸽为研究对象,根据前期克隆获得的鸽GnIH基因mRNA序列(GenBank登录号:MG589639.1)设计引物,通过PCR扩增和直接测序法检测GnIH基因SNP位点并分型,使用Haploview软件对GnIH基因SNP进行连锁不平衡分析,使用SPSS 22.0软件对GnIH基因多态性与白羽王鸽产蛋性状进行关联分析。【结果】白羽王鸽GnIH基因中共检出7个SNPs,分别位于外显子1(c.59 C＞T、c.72 T＞A)、外显子2(c.398 G＞C)和3'-UTR (c.768 C＞T、c.860 G＞A、c.909 A＞G、c.961 T＞C),除c.59 C＞T位点偏离Hardy-Weinberg平衡外(P＜0.05),其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05);c.768 C＞T与c.961 T＞C位点呈完全连锁不平衡状态(D’=1,r²=1),c.860 G＞A与c.768 C＞T、c.961 T＞C位点呈强连锁状态(D’=1,r²=0.69),其余位点呈弱连锁状态;c.398 G＞C位点突变造成了氨基酸性质和mRNA二级结构的改变,该位点与母鸽年产蛋量和初产体重均呈显著相关(P＜0.05)。【结论】GnIH基因外显子2上的SNP位点对母鸽产蛋性状有显著影响,可作为母鸽产蛋性能的候选分子标记。

骨密度是衡量骨骼强度的一个重要指标,广泛应用于人和动物骨骼健康的评估。近年来动物肢蹄问题给养殖业带来了一定程度的经济损失,尤其是养猪业。骨密度水平的测定将有助于建立养殖场动物淘汰的预警标准,及时治疗或淘汰肢蹄疾病动物,降低养殖成本,提高养殖场生产效益。鉴于骨密度水平可以预测肢蹄问题的发生,动物骨密度的活体测定将对动物生产性能和利用年限有很大提升。哺乳动物体内骨密度水平受胎次、妊娠、哺乳及激素的影响,哺乳动物骨密度活体测定可以及时反映动物骨骼健康状况,从而提升动物体内骨密度水平,改善动物骨骼健康状况。作者综述了近几年国内外对骨密度的研究进展,包括几种常用的骨密度活体测定方法,如双能X射线吸收法、定量计算机断层扫描、定量超声等,骨密度与骨骼健康之间的关系,骨密度与胎次、妊娠哺乳、激素之间的关系等,旨在为动物肢蹄病治疗或淘汰建立一个预警标准,以最大限度地提升动物的生产性能和利用年限。

【目的】探究貉卵母细胞成熟发育特征,为貉卵母细胞的体外成熟培养及优质成熟卵母细胞的挑选提供依据,以提高貉的体外受精效率。【方法】采集1~3岁(性成熟)繁殖期母貉的新鲜卵巢,制备光、电镜样品,观察貉卵母细胞成熟发育过程中细胞器变化;利用X射线微分析技术探索卵母细胞质膜化学元素变化与成熟发育的关系。【结果】根据颗粒细胞层数、卵泡直径、卵母细胞大小以及透明带的变化,将貉卵母细胞成熟发育划分为8个时期。貉卵母细胞在早期发育阶段(第Ⅰ~Ⅳ期)由颗粒细胞包围,逐渐出现透明带、卵泡腔,生发泡内的染色质越来越致密;随着卵母细胞的成熟发育(第Ⅴ~Ⅶ期),微绒毛、皮质颗粒出现;高尔基复合体、线粒体等细胞器数量明显增加,且逐渐迁移至皮质区,同时线粒体、脂滴形态发生变化。卵母细胞成熟时(第Ⅷ期),高尔基复合体及粗面内质网消失,皮质颗粒在质膜下排列;排卵后,核仁发生致密化。随着卵泡腔的增大,卵母细胞质膜表面的钠、氯和硫含量呈下降趋势,第Ⅴ期卵母细胞质膜中钠、氯和硫含量显著高于第Ⅶ期(P＜0.05),钙含量显著低于第Ⅵ期和第Ⅶ期卵母细胞(P＜0.05);钾含量呈现低-高-低的变化规律,第Ⅵ期卵母细胞质膜中钾含量显著高于第Ⅴ期和第Ⅵ期(P＜0.05)。【结论】貉卵母细胞发育至第Ⅴ期后细胞器的种类和数量增多,质膜化学元素含量发生变化,卵母细胞膜电位发生去极化,开始进入成熟发育阶段,此时的卵母细胞具备体外发育成熟的能力。

【目的】分析叉头框家族转录因子A2(forkhead box A2,FOXA2)基因第3外显子多态位点在地方猪种中的遗传多样性及其与松辽黑猪繁殖性状的相关性。【方法】采集90头健康经产松辽黑猪母猪耳组织,采用直接测序法检测FOXA2基因第3外显子SNP位点,利用SPSS 26.0软件分析FOXA2基因第3外显子SNP位点多态性(基因型频率、基因频率、遗传纯合度、遗传杂合度、有效等位基因数、多态信息含量)及其与松辽黑猪母猪繁殖性状(总产仔数、产活仔数、乳头数以及仔猪初生重、3周龄重、断奶重、断奶仔猪数)的相关性。【结果】松辽黑猪FOXA2基因第3外显子共检测出3个SNPs位点,1337 bp处SNP位点(C1337A)上发现CC、CA和AA 3种基因型;1343 bp处SNP位点(C1343G)上发现CC、CG和GG 3种基因型;1626 bp处SNP位点(C1626T)上发现CC、CT和TT 3种基因型。卡方适合性检验表明,松辽黑猪FOXA2基因第3外显子的C1337A、C1626T位点符合哈迪-温伯格平衡状态(P＞0.05),C1343G位点偏离哈迪-温伯格平衡状态(P＜0.05)。多态信息含量(PIC)计算显示,C1337A、C1626T位点为中度多态(0.25＜PIC＜0.50),C1343G位点为高度多态(PIC＞0.50)。关联分析结果表明,C1337A位点的CC基因型个体总产仔数显著高于CA基因型(P＜0.05),AA基因型个体所产仔猪3周龄重、断奶重极显著高于CC、CA基因型(P＜0.01);C1626T位点的CC基因型个体所产仔猪3周龄重、断奶重极显著或显著高于CT、TT基因型(P＜0.01;P＜0.05),CC基因型个体乳头数显著高于CT基因型个体(P＜0.05)。【结论】FOXA2基因第3外显子存在3个多态性位点,与松辽黑猪总产仔数、3周龄重、断奶重和乳头数均有显著关联性。

【目的】试验旨在探究湖南怀化地区不同种群白纹伊蚊单倍型多态性、遗传分化情况及种系发育关系。【方法】于湖南怀化地区采集30只白纹伊蚊样本,PCR扩增其核糖体18S rRNA及线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cox1)基因部分序列。利用ClustalX软件对其变异位点进行分析;运用Dnasp 5.0、Network 4.6及Arlequin version 3.0软件进行单倍型多态性与遗传分化分析;利用PhyML 3.0及Mega 5.0软件对白纹伊蚊的种系发育关系进行分析。【结果】所获全部样本的18S rRNA和cox1基因序列长度均为489和1004 bp。白纹伊蚊18S rRNA基因序列中共存在30个变异位点,17个单倍型(A1~A17,Hd=0.9149),其中单倍型A5为最古老的单倍型,白纹伊蚊18S rRNA的基因分化系数(Gst)、遗传分化系数(Fst)和基因流(Nm)分别为0.05614、0.24001和0.792;白纹伊蚊的cox1基因序列中共存在2个变异位点,3个单倍型(B1~B3,Hd=0.1908),其中单倍型B1为最古老的单倍型,白纹伊蚊cox1基因的Gst、Fst和Nm分别为0.05000、0.04762和4.999。系统发育树中,来源于怀化地区的30只白纹伊蚊均分别处于2个发育树的一个分支。【结论】来源于湖南怀化地区的白纹伊蚊个体和种群之间存在一定程度基因变异和单倍型多态性现象,但各单倍型及其个体之间具有较近的亲缘关系,且两种群白纹伊蚊个体间发生了较为频繁的基因交流,未出现遗传分化。

【目的】研究白羽王鸽肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因多态性及其与体尺和肉质性状的关系,为该品种的分子标记选育工作提供参考依据。【方法】以108只12周龄的白羽王鸽为研究对象,利用PCR直接测序法筛查白羽王鸽MyoG基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,通过RNAfold预测MyoG基因突变前后的mRNA二级结构,并利用SPSS 26.0软件分析MyoG基因SNP位点与白羽王鸽体尺和肉质性状的相关性。【结果】在白羽王鸽MyoG基因外显子3上检测到4个SNPs位点:g.590075 C＞T、g.590084 G＞A、g.590102 G＞A和g.590114 C＞T,均为同义突变,且均产生3种基因型,其中,g.590075 C＞T位点呈低度多态,其余3个SNPs位点均呈中度多态。卡方检验结果显示,g.590084 G＞A和g.590114 C＞T位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05),且两个位点之间存在强连锁不平衡。g.590084 G＞A和g.590102 G＞A位点突变导致MyoG基因mRNA序列二级结构和自由能发生改变。4个SNPs联合产生4种单倍型和9种双倍型。关联分析结果表明,g.590075 C＞T位点与白羽王鸽龙骨长呈极显著关联(P＜0.01);g.590102 G＞A位点对体斜长有极显著效应(P＜0.01);双倍型H3H3(CCAAAACC)个体的体斜长优于其余双倍型,H4H4(TTGGGGCC)个体在龙骨长和胸宽方面优于其他双倍型。g.590084 G＞A和g.590114 C＞T位点与白羽王鸽胸肌的剪切力呈极显著或显著关联(P＜0.01;P＜0.05);双倍型H3H3(CCAAAACC)个体在胸肌的pH和肉色方面优于其余双倍型,而在剪切力和失水率方面,双倍型H2H4(CTGAGGCT)和H4H4(TTGGGGCC)表现较优。【结论】MyoG基因对白羽王鸽部分体尺和肉质性状有显著影响,可作为白羽王鸽新品系培育的候选基因。

【目的】通过对苏姜猪线粒体DNA (mtDNA) D-loop高变区Ⅰ的序列扩增测序,探究苏姜猪种群的种质资源特性和遗传多样性。【方法】采集苏姜猪核心群100头经产母猪耳组织,提取DNA后扩增苏姜猪核心群母猪mtDNA D-loop高变区Ⅰ的基因片段并测序,运用NCBI在线BLAST对测序序列与参考序列进行比对、校正并寻找同源序列,确定mtDNA D-loop高变区Ⅰ序列的长度和位置;使用DnaSP v.5.10.1软件统计获得群体中核苷酸多态位点和变异位点数量,分析单倍型多样度(Hd)、核苷酸多样性(Pi)、平均核苷酸差异度(K)等参数;使用Mega 7.0软件对不同单倍型进行基于Kimura’s 2-prarmetermodel的遗传距离计算,采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)对苏姜猪的4个单倍型、17个中国地方猪种、欧洲家猪(登录号:AF034253.1)的mtDNA D-loop高变区Ⅰ序列构建系统发育树。【结果】对100头苏姜猪的mtDNA D-loop序列高变区Ⅰ进行扩增测序,获得长度为429 bp的有效序列,获得的序列中,AT含量为63.1%,GC含量为36.9%;中性检验Tajima’s D值为-1.80517(P＜0.05),证实苏姜猪种群显著性偏离中性检验;被测序列中检测到19个变异位点,定义了4个单倍型,单倍型多样度为0.578,核苷酸多样性为0.0032;种群内4个单倍型之间的平均遗传距离在0.004~0.031之间。系统发育树结果显示,群体分为国内和国外2个类群,苏姜猪4个单倍型都聚集在国内分支上,其中单倍型H2和二花脸猪聚为一类,单倍型H4和姜曲海、皖南花猪等聚为一类。【结论】苏姜猪种群mtDNA D-loop高变区Ⅰ多态位点比例高,单倍型多样度高,核苷酸多样性低;苏姜猪群体内优势单倍型的遗传距离较近,占比较高,反映出苏姜猪群体母系来源较少。

外泌体(exosome)是一种广泛存在于各种体液环境和部分组织中的纳米级、均一性膜性囊泡,主要由蛋白质、脂质、mRNA、miRNA和lncRNA等多种生物成分构成。近年来,研究学者已从不同动物的卵泡液中分离出外泌体,并证实卵泡液外泌体参与卵泡颗粒细胞的增殖、卵子的形成及发育、动物受精、胚胎发育、以及雄性动物生殖功能等一系列生殖过程,为进一步研究卵泡液外泌体对哺乳动物生殖功能的调控提供新思路。作者重点阐述了卵泡液外泌体分离鉴定的方法、主要成分以及调控哺乳动物生殖功能的分子机制的最新进展,为全面了解外泌体结构功能、生发凋亡和作用机制提供参考,为利用外泌体探索动物生殖理论和提高动物繁殖技术并将其应用于生产实际提供相关基础信息。

【目的】研究猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白的免疫原性,探索其作为疫苗候选抗原的可能。【方法】对NCBI中不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中OmpW和TbpA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并对OmpW和TbpA蛋白进行生物信息学分析。基于此,构建重组表达菌株pET28a-OmpW-BL21和pET28a-TbpA-BL21,重组OmpW和TbpA蛋白经镍柱亲和层析纯化后与氢氧化铝佐剂混匀制备亚单位疫苗,免疫小鼠后使用猪多杀性巴氏杆菌GX-PmD4菌株攻毒,评估OmpW和TbpA蛋白的免疫原性。【结果】相似性比对发现,OmpW和TbpA蛋白在不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中高度保守;SignalP 6.0 Server和TMHMM Server v.2.0软件预测发现OmpW蛋白有信号肽和跨膜区,而TbpA蛋白有信号肽无跨膜区;ABCpred软件分析显示,OmpW和TbpA蛋白分别有14和22个B细胞抗原表位;SOPMA和SWISS-MODEL软件进一步预测蛋白结构表明:OmpW和TbpA蛋白的α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占16.18%、5.39%、36.76%、41.67%和40.42%、5.69%、16.77%、37.13%。经原核表达获得的重组OmpW和TbpA蛋白均具有较强的抗原性。在免疫小鼠后的14和28 d,与对照组相比,血清中OmpW、TbpA特异性抗体水平极显著上升(P＜0.01)。小鼠免疫攻毒试验结果显示,重组OmpW组和TbpA组的小鼠存活率分别为50.0%和37.5%。【结论】本研究成功表达了猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白,且重组OmpW蛋白免疫原性较强,可作为猪多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗的有效候选抗原。

【目的】克隆德州驴血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因,对其进行原核表达及多克隆抗体制备,同时检测HO-1基因在德州驴不同组织中的表达情况,为后期研究HO-1基因功能提供支撑材料。【方法】参考GenBank中公布的马HO-1基因序列(登录号:XM_023631135.1)设计特异性引物,从驴原代肺泡巨噬细胞(donkey primary alveolar macrophages,DPAMs)中提取RNA,反转录为cDNA后进行PCR扩增HO-1基因编码区(coding sequences,CDS),对测序所获序列与其他物种进行相似性比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对HO-1基因编码蛋白进行生物信息学分析。将HO-1基因序列克隆至pCold-SUMO载体进行原核表达,经镍柱亲和层析纯化后,以重组的HO-1蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blotting检测多克隆抗体特异性及与抗原结合的最大稀释度。利用免疫组化试验检测德州驴4种组织中HO-1蛋白的表达水平。【结果】德州驴HO-1基因CDS区全长873 bp,编码290个氨基酸,其氨基酸序列与马的相似性最高,亲缘关系最近,与鸡的相似性最低,亲缘关系最远。德州驴HO-1蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白,分子质量为33.04 ku,无信号肽,存在1个跨膜区,二级结构以α-螺旋为主。ELISA、Western blotting结果显示,针对HO-1制备的多克隆抗体与HO-1结合最大的稀释度为1∶102 400,宿主HO-1蛋白可被制备的多克隆抗体识别。免疫组化结果显示,德州驴4种组织中均有效表达HO-1蛋白。【结论】本研究成功获得德州驴HO-1重组蛋白,并制备特异性多克隆抗体,为后续深入探究HO-1基因在马属动物感染病原过程中的作用提供参考依据。

【目的】研究旨在对猫细小病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)洛阳分离株VP2蛋白进行原核表达和鼠源多克隆抗体制备。【方法】根据已公布的FPV VP2基因序列(GenBank登录号:EU018143.1)设计1对特异性引物,以洛阳地区7例疑似FPV感染猫粪便为样本提取DNA,对VP2基因进行PCR鉴定及测序,利用Mega 11.0软件对VP2基因进行遗传进化分析;应用在线软件预测分离株VP2蛋白结构特征并找出优势抗原表位,克隆VP2优势抗原(sVP2)并连接pET-32a (+)载体,构建pET-32a-sVP2重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞后进行诱导表达,对重组蛋白表达条件进行优化,并使用SDS-PAGE与Western blotting方法进行鉴定;将pET-32a-sVP2用镍柱亲和层析蛋白纯化后免疫BABL/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价。【结果】分离得到1株FPV,命名为LY-1。遗传进化分析发现,该毒株属于FPV-G2亚群,与北京株(GenBank登录号:MT270581)亲缘关系最近。生物信息学分析显示,VP2属于稳定膜内蛋白,无信号肽与跨膜区,在N-端具有丰富的B细胞抗原表位(1―800 bp,sVP2)。试验成功构建pET-32a-sVP2重组质粒并表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约50 ku,主要以包涵体形式存在,在30 ℃、1 mmol/L IPTG诱导6 h蛋白表达量最佳;Western blotting结果表明,重组蛋白能与鼠抗His单克隆抗体发生特异性反应;ELISA结果表明,该重组蛋白抗体效价为1∶128 000,能够较好地识别免疫原sVP2和原核表达VP2蛋白并发生特异性反应。【结论】本试验克隆获得FPV sVP2片段,并制备多克隆抗体,为进一步研究VP2在FPV复制和致病过程中的作用及建立诊断FPV方法提供参考。

【目的】探究大肠杆菌噬菌体vB_EcoP_GN07的生物学特性和全基因组特征,为开发噬菌体"鸡尾酒"制剂防治致病性大肠杆菌病提供生物学材料。【方法】采用双层平板法从广西南宁某养鸡场分离到1株大肠杆菌裂解性噬菌体vB_EcoP_GN07;通过透射电镜观察、宿主谱测定、pH和温度稳定性评估、最佳感染复数(MOI)测定、一步生长曲线测定、全基因组测序等方法了解噬菌体的形态学、生物学特性和全基因组特性。【结果】透射电镜显示,vB_EcoP_GN07头部直径为45 nm±5 nm,尾部长约25 nm,属于短尾噬菌体科,宿主特异性强;在4~60 ℃可以保持效价稳定,在pH 3.0~11.0可以保持噬菌体活性;该噬菌体的最佳MOI为10^-2;一步生长曲线显示该噬菌体潜伏期为60 min,裂解量为560 PFU/cell;测序结果显示其属于双链线型DNA,长度为70 120 bp,GC含量为42.8%;噬菌体vB_EcoP_GN07共有81个开放阅读框,其中23个为已知功能蛋白。经BLASTN比对显示,vB_EcoP_GN07与NCBI数据库中其他噬菌体相似性较低,符合N4-like属噬菌体的特点,没有发现与耐药性、毒力因子、毒素和溶源性相关蛋白。【结论】试验成功分离到1株大肠杆菌噬菌体vB_EcoP_GN07,其具有裂解能力强、特异性强、耐酸碱的特点,与其他噬菌体相似性较低,为1株新的N4-like噬菌体。结果可为未来应用大肠杆菌噬菌体vB_EcoP_GN07开发新型杀菌剂提供理论依据。

【目的】从新疆双峰驼淋巴细胞基因组中筛选出抑制素α亚基(INHα)特异性纳米抗体(VHH)基因,制备新型抑制素免疫制剂,以期间接提高动物血液促卵泡素(FSH)水平、排卵率和产羔率。【方法】利用pET32a-INHA原核表达载体诱导表达INHα蛋白并纯化,纯化后的INHα蛋白经尿素溶液复性后免疫新疆双峰驼。通过对免疫前和免疫后全血中淋巴细胞VHH基因进行巢式PCR扩增、高通量测序并建立VHH氨基酸差异数据库;分别对免疫前和免疫后血清及从免疫后血清中筛选出的INHα特异性抗体进行液相色谱质谱/质谱联用(LC-MS/MS)分析获得质谱数据;对质谱数据进行蛋白数据库检索和数据分析后建立INHα特异性抗体和免疫后特异性抗体的肽段库和蛋白库;通过将VHH氨基酸差异数据库分别与INHα特异性抗体和免疫后特异性抗体的肽段库进行序列比对,筛选出INHα特异性纳米抗体基因;对筛选出的VHH基因进行序列比对、三维结构预测和蛋白-蛋白模拟对接。【结果】试验成功诱导表达并纯化了INHα蛋白,INHα蛋白免疫新疆双峰驼获得的抗体效价达1∶1024000;成功从淋巴细胞中克隆出VHH基因,从免疫后血清中筛选出INHα特异性抗体;通过高通量测序、质谱分析及数据处理筛选出5个INHα特异性VHH基因,其氨基酸序列比对结果显示,整体相似性为70.98%,其中互补决定区1(CDR1)长10~13个氨基酸,CDR2长12~13个氨基酸,CDR3长12~22个氨基酸,CDR3在3个互补决定区中氨基酸序列差异最大;系统进化树显示,选择的5条氨基酸序列具有丰富的多样性;蛋白-蛋白模拟对接结果表明,除VHH-267外其余4株纳米抗体均可与INHα配对连接,且主要作用力为疏水相互作用和氢键。【结论】本研究首次通过高通量测序技术联合质谱分析从新疆双峰驼淋巴细胞基因组中筛选出5个INHα特异性VHH基因。本研究结果可为提高动物机体FSH水平及排卵率提供理论指导和技术支持,对繁殖免疫学的发展具有一定参考价值。

【目的】探究牦牛屠宰场中存在的单增李斯特菌对牦牛肉造成污染的风险。【方法】通过细菌分离培养、形态观察、生化试验及分子学方法对牦牛屠宰场50份污水样品中的单增李斯特菌进行分离鉴定;通过PCR方法对分离株血清型和毒力基因进行鉴定和检测,并测定分离株在不同生长条件下D_{600 nm}值;通过细胞的黏附和侵袭试验及小鼠半数致死量(LD₅₀)确定分离株的毒力。【结果】从50份污水样品中分离出1株革兰氏阳性短杆状细菌。分离株在李斯特菌显色培养基上为蓝绿色菌落,镜检为革兰氏阳性两端钝圆的短杆状菌,疑似为单增李斯特菌。生化试验结果显示,分离株可水解七叶苷,发酵葡萄糖、麦芽糖和鼠李糖,MR、VP、动力、过氧化氢酶试验为阳性,甘露醇和木糖发酵试验为阴性。系统进化树显示,分离株与单增李斯特菌EDG-e具有高度同源性,序列相似性为99%,血清型鉴定其血清型为1/2a。毒力基因检测结果显示,分离株携带inlB、inlC、inlJ、actA、plcA、prfA、mpl、hly、inlA、SigmaB毒力基因。抗应激能力试验显示,分离株在低温、强酸、强碱、高盐、乙醇胁迫和氧化等极端环境中的生长速度极显著高于标准株ATCC 19111(P＜0.01)。细胞试验显示,分离株对RAW246.7细胞的黏附率为8.3%,侵袭率为2.5%,其黏附和侵袭能力均极显著高于标准株ATCC 19111(P＜0.01)。对Caco-2细胞的黏附率为6.2%,侵袭率为1.5%,黏附和侵袭能力均极显著高于标准株ATCC 19111(P＜0.01)。动物试验结果显示,分离株对小鼠的LD₅₀为10^4.7 CFU。【结论】本研究获得的单增李斯特菌分离株血清型为1/2a,为引起人类李氏杆菌病的主要血清型,其抗应激能力较强,属于强毒株。本研究为牧区单增李斯特菌的监测提供了分子生物学基础,同时为保障牦牛肉食品安全提供理论依据。

【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX1基因序列(登录号:XM_021087822.1),设计特异性引物PCR扩增DDX1基因全长并连接至pMD19-T克隆载体,双酶切鉴定成功后连接至pcDNA3.1表达载体;连接产物转化后筛选阳性菌落;培养IPI-2I细胞,取传代2次的细胞铺于6孔板内进行后续试验,将阳性菌落的重组质粒转染至6孔板培养24 h后收集蛋白质,Western blotting检测DDX1转染效率;以感染复数(MOI)为1.0的PEDV感染已转染pcDNA3.1-DDX1或PBS (对照)的IPI-2I细胞,建立PEDV感染细胞模型,PEDV感染12 h后分别收集细胞总蛋白质和RNA;间接免疫荧光试验检测细胞水平上PEDV N蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测PEDV N基因mRNA表达水平,Western blotting检测PEDV N蛋白的表达水平;使用生物信息学软件预测DDX1蛋白的磷酸化位点;免疫沉淀试验检测PEDV感染IPI-2I细胞12 h后DDX1的磷酸化水平。【结果】PCR成功扩增得到大小为2 223 bp的DDX1目的基因条带。双酶切鉴定结果显示,成功构建pMD19-T-DDX1克隆载体和pcDNA3.1-DDX1真核表达载体。与PBS组相比,转染pcDNA3.1-DDX1的细胞DDX1蛋白表达水平极显著上升(P＜0.01),表明DDX1转染成功。间接免疫荧光试验结果显示,与PBS组相比,PEDV感染组中出现大量绿色荧光信号,表明PEDV感染IPI-2I细胞模型构建成功;与PBS组相比,PEDV N蛋白的荧光信号明显减少,PEDV N基因mRNA表达水平及蛋白表达水平均极显著降低(P＜0.01)。生物信息学分析发现,DDX1蛋白具有多个磷酸化位点,其中包括17个丝氨酸、12个苏氨酸及6个酪氨酸。免疫沉淀试验结果显示,与未感染组相比,PEDV感染组中DDX1磷酸化水平极显著上升(P＜0.01)。【结论】本研究成功构建了pcDNA3.1-DDX1真核表达载体,发现PEDV感染IPI-2I细胞12 h后,DDX1抑制了PEDV的复制,升高了磷酸化水平,说明DDX1在PEDV感染期间可能通过磷酸化抑制PEDV的复制。

【目的】制备携带猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗原表位的铁蛋白纳米颗粒,并评价其免疫原性,为PEDV的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】将PEDV纤突蛋白S的COE和S1D区域设计成串联表位S1CD并进行密码子优化和合成,构建单独表达S1CD蛋白的重组质粒pET28a-S1CD及融合表达S1CD蛋白和铁蛋白亚基的重组质粒pET28a-S1CD-Ferritin,并在大肠杆菌中进行诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1CD、S1CD-Ferritin蛋白在大肠杆菌内是否正确表达,并通过透射电镜观察其形态结构。将纯化的S1CD-Ferritin蛋白免疫小鼠,同时以纯化的S1CD蛋白和PBS为对照,采用间接ELISA方法检测各组小鼠血清的S特异性抗体水平和γ-干扰素(IFN-γ)含量,通过中和试验测定中和抗体水平,分析重组蛋白在小鼠体内的免疫原性。【结果】成功构建了重组质粒pET28a-S1CD和pET28a-S1CD-Ferritin。SDS-PAGE结果显示,高效表达出了S1CD和S1CD-Ferritin重组蛋白,大小分别约为22和39 ku,均以包涵体形式存在。Western blotting鉴定结果显示,S1CD和S1CD-Ferritin蛋白均与PEDV阳性血清发生特异性反应,表明原核表达得到的S1CD和S1CD-Ferritin重组蛋白具备良好的反应原性。透射电镜结果显示,纯化后的S1CD-Ferritin蛋白可形成大小均一、粒径为12~20 nm的球形颗粒,表明S1CD-Ferritin蛋白已成功组装为纳米颗粒。血清抗体检测结果显示,首次免疫7 d后,S1CD-Ferritin蛋白免疫组抗体水平迅速提高,显著高于S1CD蛋白免疫组(P＜0.05);首次免疫28 d后,S1CD-Ferritin蛋白免疫组的中和抗体水平及IFN-γ含量均显著高于S1CD蛋白免疫组(P＜0.05)。【结论】融合铁蛋白的PEDV抗原表位在大肠杆菌中得到高效表达,并能自组装形成纳米颗粒,显著增强目的抗原的免疫原性,为研究新的PEDV亚单位疫苗拓宽了研究思路。

【目的】设计合成猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)的抗原表位,制备并鉴定多克隆抗体。【方法】为了特异性检测PDCoV RBD抗原,应用生物信息学技术预测其潜在抗原表位,将表位氨基酸序列与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株以及14株其他猪冠状病毒株进行相似性比对,将筛选的优势抗原表位与载体蛋白血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联,合成多肽并免疫小鼠,制备PDCoV RBD特异性抗体。通过Western blotting试验对不同系统表达的PDCoV RBD以及PDCoV、TGEV和PEDV感染ST细胞表达的S蛋白进行鉴定,通过间接ELISA方法测定抗体效价。【结果】经序列比对,利用生物信息学技术预测合成的表位抗原与δ冠状病毒属中的其他15株病毒株(0~14.28%)以及14株其他猪冠状病毒株(0~7.14%)序列相似性非常低,具有良好的保守性;Western blotting结果显示,制备的多肽抗体1∶500、1∶1 000、1∶2 000倍比稀释后均能特异性识别转染pcDNA3.1-PDR-Strep的Expi293F表达的PDCoV RBD蛋白、杆状病毒感染SF9细胞表达的PDCoV RBD蛋白,1∶1 000稀释后能够检测到PDCoV感染ST细胞表达的PDCoV S蛋白,而在TGEV和PEDV感染的细胞中未检测到特异性蛋白的表达;ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的效价可以达到1∶12 800。【结论】利用生物信息学技术成功预测PDCoV RBD蛋白抗原表位,免疫后获得的抗体具有较好的特异性。

巨噬细胞表达基因1(macrophage-expressed gene 1,Mpeg1)编码蛋白是攻膜复合物/穿孔素(membrane attack complex/perforin,MACPF)超家族中的一种穿孔蛋白,广泛存在于动物体内,被认为是现存最古老的MACPF穿孔蛋白。Mpeg1参与宿主先天性免疫,对细菌、病毒和寄生虫均具有杀伤作用。在抗菌免疫中,高表达Mpeg1的细胞可抵御胞内菌、胞外菌、耐酸菌、耐药菌等各种致病菌,这种广谱杀菌活性限制病原菌在宿主体内传播和感染,并间接抑制慢性进行性疾病的发展。在抗寄生虫免疫中,Mpeg1能直接杀伤刺激隐核虫和迈阿密虫等原虫。在抗病毒免疫中,细胞因子诱导表达Mpeg1以抵御病毒感染。近几年的研究表明,Mpeg1还在炎症反应、抗原呈递和一些肿瘤疾病的初步诊断中发挥重要作用。Mpeg1发挥病原清除作用的分子机制为:被诱导表达的Mpeg1通过泛素化在细胞内再分布,最终在溶酶体中与病原体共定位,酸性环境触发Mpeg1在细菌表面打孔,各种抗微生物效应物进入病原菌共同参与病原清除。笔者对Mpeg1编码蛋白的发现、病原清除及其他免疫相关功能及其分子作用机制进行综述,以期为Mpeg1的深入研究和应用提供参考。

牛病毒性腹泻病(bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染导致的传染病。该病会导致牛生产性能下降,给全球养牛业带来严重的经济损失。BVD的临床表现和病理变化与其他牛源腹泻病毒病相似,因此有必要根据不同的条件选择快速高效的BVDV诊断方法,及时采取措施阻断BVDV在牛群间、BVDV持续感染牛(persistently infected,PI)与健康牛之间传播,减少BVDV对养牛业造成的经济损失。用于BVDV检测的方法很多,主要有病毒分离鉴定、荧光定量RT-PCR、RT-PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、胶体金免疫检测技术(GICT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、抗原捕获ELISA (AC-ELISA)、间接免疫荧光法(IFA)等。近年一些新兴技术和优化的方法被应用于BVDV的检测,如抗体液相芯片技术、CRISPR-LwCas13a系统、双重纳米RT-PCR法等,均具有特异性强和灵敏度高等优点。作者从抗原、抗体两个方面总结了BVDV检测方法的研究进展,并比较各检测方法的优缺点,便于各级兽医研究机构和生产单位根据实际情况选择合适高效的BVDV检测方法,以期为BVD的流行病学调查和防治提供参考依据。

【目的】探讨丁酸梭菌和丁酸钠对高脂饮食刺激下小鼠精液品质和睾丸组织的影响,为治疗雄性生殖疾病提供试验基础和理论支持。【方法】试验1:将32只8周龄C57BL/6雄性小鼠随机均分为4组,对照组(NC)饲喂基础饲粮,高脂组(HFD)、丁酸梭菌处理组(HFD+C.butyricum)和丁酸钠处理组(HFD+Sodium butyrate)均饲喂含60%脂肪的高脂饲料,对照组和高脂组灌胃生理盐水,丁酸梭菌处理组灌胃1×10⁸CFU/kg丁酸梭菌,丁酸钠处理组灌胃300 mg/kg丁酸钠,每天1次。试验2:将16只8周龄C57BL/6雄性小鼠随机均分为2组,对照组正常饮食补充生理盐水,试验组小鼠通过灌胃补充1×10⁸CFU/kg丁酸梭菌溶液,每天1次,12周后处死采样。利用精液检测系统CASA检测精液品质,HE染色观察睾丸组织病理变化;利用试剂盒检测睾丸组织总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)、血清睾酮(T)含量,以及睾丸组织碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脱氢酶(LDH)及γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)活性。【结果】试验1中,与高脂组相比,丁酸梭菌处理组小鼠体重极显著降低(P＜0.01),小鼠精子活力、A+B级精子数、精子直线运动能力、平均路径速度均显著提高(P＜0.05),直线速度极显著提高(P＜0.01),小鼠睾丸组织AKP活性显著提高(P＜0.05);丁酸钠处理组小鼠体重极显著降低(P＜0.01),睾丸指数、精子直线运动能力、精子向前运动力、直线速度和摆动性均显著提高(P＜0.05),精子活力、A+B级精子数、平均路径速度及睾丸组织γ-GT活性均极显著提高(P＜0.01),此外,丁酸钠还显著增加了高脂小鼠血清睾酮含量、ACP活性(P＜0.05),显著降低了小鼠睾丸组织MDA含量(P＜0.05)。睾丸组织病理切片显示,各组小鼠睾丸组织形态并无明显差异。试验2中,与对照组相比,试验组小鼠睾丸指数极显著升高(P＜0.01),血清中睾酮水平显著升高(P＜0.05),精液品质及睾丸组织抗氧化指标均无显著变化(P＞0.05)。【结论】丁酸梭菌及丁酸钠可显著升高小鼠血清睾酮含量,改善睾丸组织抗氧化能力,提高精子质量和数量,保护睾丸组织结构,有效保护肥胖导致的雄性小鼠生殖系统损伤。

【目的】研究制备一种新型抗菌肽——生泰素奶牛成膜型后药浴液,对其有效性和安全性进行表征。【方法】运用单因素影响试验及L₉(3)³正交试验筛选生泰素奶牛后药浴液最优配方;运用体外杀菌试验表征杀菌有效性;通过溶血性试验、细胞毒性试验、单次给药小鼠皮肤刺激性试验、多次给药小鼠皮肤刺激性试验及小鼠皮肤致敏性试验验证安全性。【结果】正交试验结果显示,以7%的成膜剂PVA1788为基质配制膜溶液,甘油的试验影响最大,其次为吐温80;生泰素奶牛后药浴液的最优配方为:增塑剂甘油的最优添加体积分数为4%,表面活性剂吐温80的最优添加体积分数为1%,增稠剂普鲁兰多糖的最优添加质量百分浓度为0.4%。生泰素奶牛后药浴液在30 min内可杀灭99.999%以上供试金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌,杀菌效果与聚维酮碘相当。生泰素奶牛后药浴液溶血性和细胞毒性均低于聚维酮碘后药浴液。单次和多次小鼠皮肤刺激性试验及皮肤致敏性试验结果显示,生泰素奶牛后药浴液对小鼠皮肤无刺激性和致敏性。【结论】生泰素奶牛后药浴液是一种制备工艺简单、有效、绿色、安全的成膜型后药浴液,预期能有效预防奶牛乳房炎的发生,保证原料乳的质量安全,促进乳品行业健康发展。

【目的】基于网络药理学结合分子对接技术探究诃子鞣酸防治奶牛子宫内膜炎的作用,并阐明其潜在机制。【方法】通过SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库收集和预测诃子鞣酸的作用靶点,通过UniProt数据库标准化并去重。从OMIM和DRUGBANK数据库中获取奶牛子宫内膜炎相关基因并去重,绘制Venn图获取诃子鞣酸和奶牛子宫内膜炎交集靶点。使用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,使用DAVID数据库进行GO功能和KEGG通路富集分析。利用分子对接技术对KEGG通路富集分析后得到的关键通路靶点进行分子对接,以验证网络药理学分析结果的准确性。【结果】通过多个数据库检索及筛选获得诃子鞣酸潜在靶点基因333个,奶牛子宫内膜炎相关靶点基因342个,共有18个交集靶点。PPI结果显示,诃子鞣酸可能作用于前列腺素-内过氧化物酶合酶1(prostaglandin G/H synthase 1,PTGS1)、PTGS2、花生四烯酸12-脂氧合酶(arachidonate 12-lipoxygenase,ALOX12)、ALOX15等18个关键靶点。GO功能和KEGG通路富集分析结果显示,诃子鞣酸可通过脂氧合酶途径、花生四烯酸代谢通路、雌激素信号等通路防治奶牛子宫内膜炎。分子对接结果显示,诃子鞣酸与所得关键靶点均具有良好的结合活性,诃子鞣酸可通过多靶点发挥防治奶牛子宫内膜炎的作用,证明网络药理学预测结果准确。【结论】诃子鞣酸可能通过与PTGS1、PTGS2、ALOX12、细胞肿瘤抗原p53(cellular tumor antigen p53,TP53)结合,在脂氧合酶通路、花生四烯酸代谢过程上发挥防治奶牛子宫内膜炎的作用。

【目的】探究α-酮戊二酸二甲酯(dimethyl alpha-ketoglutarate,DMKG)预处理对犬脂肪源间充质干细胞(canine adipose-derived mesenchymal stem cells,cAD-MSCs)免疫调节的影响。【方法】利用不同浓度的DMKG培养基,探索DMKG对cAD-MSCs增殖的影响。用1 mmol/L DMKG预处理cAD-MSCs后,采用ELISA方法检测培养上清液中炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10及转化生长因子-β(TGF-β)的水平。以含100、250、500、1000、2000 ng/mL的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)培养基培养RAW264.7细胞,24 h后采用CCK-8法检测细胞存活率,筛选最适LPS浓度以建立RAW264.7细胞炎症模型。把RAW264.7细胞分为空白对照组、LPS组、MSCs组及DMKG-MSCs组,将DMKG预处理后的cAD-MSCs与250 ng/mL LPS处理的RAW264.7细胞共培养24 h后,采用CCK-8法检测细胞增殖活性,Transwell法检测细胞迁移能力,Griess法检测培养上清液中一氧化氮(NO)含量,实时荧光定量PCR检测一氧化氮合成酶(iNOs)、IL-1β、IL-6、IL-10和精氨酸酶-1(Arg-1)的mRNA表达水平,流式细胞仪检测M1巨噬细胞表面标记物CD80⁺、CD86⁺。【结果】与MSCs组相比,DMKG预处理cAD-MSCs后培养上清液中TGF-β、IL-10的分泌显著升高(P＜0.05),而IL-1β、IL-6的分泌受到显著抑制(P＜0.05),TNF-α分泌无显著差异(P＞0.05)。LPS浓度为250 ng/mL时,RAW264.7细胞增殖活性达到最高。与LPS组相比,MSCs组和DMKG预处理后的cAD-MSCs均能极显著抑制RAW264.7细胞的增殖活性和迁移能力(P＜0.01),抑制细胞NO的释放量并下调iNOs的mRNA表达水平(P＜0.01);此外,下调RAW264.7细胞IL-1β(P＜0.01)、IL-6 mRNA表达水平,上调IL-10 mRNA表达水平(P＜0.05;P＜0.01),M2巨噬细胞表面标记物Arg-1的mRNA表达水平极显著上调(P＜0.01),M1巨噬细胞表面标记物CD80⁺、CD86⁺的表达极显著降低(P＜0.01);与MSCs组相比,DMKG预处理的cAD-MSCs抑制巨噬细胞激活效果更好。【结论】DMKG能有效增强cAD-MSCs的免疫调节作用,表现营养因子TGF-β和抑炎细胞因子IL-10表达增多,促炎细胞因子IL-1β和IL-6表达减少,抑制LPS刺激条件下RAW264.7细胞的激活,减轻细胞炎症反应。

【目的】研究不同禽源碳青霉烯类耐药大肠杆菌(carbapenem-resistant Escherichia coli,CREC)的群间分布、耐药特征及菌株间亲缘关系,为阻断CREC的潜在危害提供技术支持。【方法】在胶东地区采集肉鸡、蛋鸡、水禽三类家禽泄殖腔拭子1 131份,利用选择性分离培养、质谱鉴定、PCR、微量肉汤稀释法、多位点序列分型(MLST)及全基因组测序(WGS)等方法进行CREC菌株鉴定与分析。【结果】共分离出364株bla_NDM基因阳性的CREC菌株,分离率为32.18%,阳性场总体占比为76.32%,肉鸡场和个体阳性率均最高,分别为93.33%和55.56%。三类禽源菌株均多重耐药,83.65%菌株对8类及以上药物同时耐药,对多数测试药物耐药率在80%以上。肉鸡多重耐药问题最严重,水禽次之,蛋鸡相对较轻。45株全基因组测序的CREC菌株携带12类52种耐药基因,4种bla_NDM变异体,以bla_NDM-5(77.78%)为主,三类家禽对同类耐药基因的检出率存在差异。共检出46种ST型,多样性比为44.23%。三类家禽CREC菌株间单核苷酸多态性(SNPs)差异位点为82~71307个,且携带的优势型不同。【结论】携带bla_NDM的CREC在不同家禽养殖场尤其是肉鸡场广泛存在,以bla_NDM-5亚型最为常见,对多种抗菌药普遍耐药,且携带大量耐药基因,以质粒传播为主。CREC菌株在三类家禽中呈多样化分布,且多数菌株间亲缘关系相差较远。提示应针对不同动物群体,加强监测和影响因素研究,以降低CREC的潜在风险。

【目的】为合理防控肠炎沙门菌感染,本试验针对四川4个地区禽源肠炎沙门菌的感染情况开展研究。【方法】通过细菌分离培养、生化试验及分子学方法进行细菌分离鉴定;进一步通过K-B法检测分离菌对14种抗菌药物的敏感性,并对分离菌进行耐药基因、毒力基因及致病性研究。【结果】细菌分离培养结果显示,分离菌符合沙门菌的培养特性,镜检为革兰氏阴性短杆菌,生化鉴定结果均符合沙门菌生化特性。沙门菌特异性毒力靶标基因invA和肠炎沙门菌特异性毒力靶标基因sdfI PCR扩增结果显示,获得大小分别为571和304 bp的目的条带,与预期大小相符,确认分离到10株肠炎沙门菌,总分离率为2.8%(10/361)。药敏试验结果显示,分离菌对氨基糖苷类、磺胺类、多肽类抗菌药耐药率较高;氨基糖苷类药物中,对庆大霉素和链霉素的耐药率分别为50%(5/10)和70%(7/10);磺胺类药物中,对复方新诺明和磺胺异噁唑的耐药率分别为40%(4/10)和100%(10/10);多肽类药物中,对多黏菌素B耐药率达90%(9/10);分离菌对喹诺酮类药物均表现敏感,对头孢类、β-内酰胺类和四环素类较敏感。分离菌普遍存在多重耐药现象,14种耐药基因中检出四环素类耐药基因tetB(40%)和tetM(90%),氨基糖苷类耐药基因aadA1(80%)和aph(3’)-Ⅱa(90%),β-内酰胺类耐药基因bla_TEM-1(100%),磺胺类耐药基因sul3(100.0%);6种毒力相关基因中,ssaQ(SPI-2)、mgtC(SPI-3)、spi4D(SPI-4)、pipA(SPI-5)、invA(SPI-1)和spvB的检出率分别为60%、80%、70%、60%、100%和80%。致病性试验结果显示,小鼠灌胃分离菌菌液24 h后出现死亡,剖检及病理切片观察到脏器淤血、出血,细胞变性等,肠段出现绒毛断裂脱落。【结论】本研究成功分离得到10株禽源肠炎沙门菌,分离菌具有较强耐药性和多重耐药现象,毒力基因检出率较高且有较强的致病性,本研究结果可为肠炎沙门菌病的防控及临床治疗提供参考。

【目的】研究小承气散对便秘母猪肠道微生物菌群的影响,探讨其改善便秘的机制。【方法】选取27头经产二元母猪(大白猪×长白猪,3~5胎),依据排便情况分为健康对照组、便秘组和试验组,每组3个重复,每个重复3头。健康对照组和便秘组正常饲喂,试验组按60 g/(头·d)的剂量在饲料中添加小承气散,每天1次,连续3 d,第4天采集各组母猪新鲜粪便样品,提取微生物基因组总DNA,采用Illumina MiSeq测序技术检测样品微生物群落多样性。【结果】便秘组母猪粪便中微生物菌群发生显著改变,与健康对照组和试验组的Simpson指数差异显著(P＜0.05)。在门水平上,与健康对照组相比,便秘组母猪肠道微生物中厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)显著减少(P＜0.05),变形菌门(Proteobacteria)极显著增加(P＜0.01);与便秘组相比,试验组母猪肠道微生物中拟杆菌门显著增加(P＜0.05),厚壁菌门有增加的趋势(P＞0.05),变形菌门极显著减少(P＜0.01)。在属水平上,与健康对照组相比,便秘组母猪肠道微生物中乳杆菌(Lactobacillus)和普雷沃菌属(Prevotella)极显著减少(P＜0.01),梭菌属ⅪVa (Clostridium_ⅪVa)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)显著减少(P＜0.05),不动杆菌属(Acinetobacter)和埃希氏杆菌属-志贺氏杆菌(Escherichia_Shigella)极显著增加(P＜0.01),梭状芽孢杆菌属(Clostridium_sensu_stricto)和罗姆布茨菌属(Romboutsia)显著增加(P＜0.05);与便秘组相比,试验组母猪肠道微生物中普雷沃菌属极显著增加(P＜0.01),毛螺菌科显著增加(P＜0.05),不动杆菌属极显著降低(P＜0.01);粪便中乙酸、丁酸和丙酸含量显著提高(P＜0.05)。【结论】小承气散可改善便秘母猪肠道微生物结构,提高肠道短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)含量,使肠道微生物达到新的平衡。

【目的】拟分离1株对大肠杆菌具有良好抑菌效果且适应性广泛的噬菌体,为开发新的大肠杆菌防治方法提供基础。【方法】以大肠杆菌H11为宿主菌,采用双层琼脂平板法从污水样品中分离纯化1株大肠杆菌噬菌体,电镜下观察噬菌体的形态,测定噬菌体的效价、宿主谱、最佳感染复数、一步生长曲线、pH稳定性与温度敏感性,对噬菌体的全基因组进行分析和序列比对,并探究该噬菌体在液体培养基中对H11的抑制效果。【结果】成功分离到1株裂解性大肠杆菌噬菌体,命名为EP_H11(登录号:OP688485)。双层琼脂平板法结果显示,该噬菌体能够形成大小一致、中间有透明亮点、周围有光晕的噬斑,噬菌体裂解效价可达10⁹~10¹⁰ PFU/mL。电镜观察显示噬菌体EP_H11头部呈规则的多面体状,直径约85 nm,尾部直径约23 nm,长度约109 nm。以大肠杆菌H11为宿主菌测得EP_H11的最佳感染复数是0.1,一步生长曲线结果显示其潜伏期为40 min,爆发期为80 min,裂解量为200 PFU/cell。该噬菌体在pH 4.0~10.0的环境中至少可以存活2 h以上,并能够在10~60 ℃下保持稳定90 min。结合透射电镜观察及全基因组分析结果显示,噬菌体EP_H11属于有尾病毒目、长尾噬菌体科、肌尾噬菌体属。噬菌体基因组总片段长度为111 373 bp,GC含量为44.49%。噬菌体线性对比结果显示,大肠杆菌噬菌体EP_H11的基因组与噬菌体Escherichia phage vB_EcoM_IME392同源性最高。系统发育进化树分析结果表明,噬菌体EP_H11与肌尾属噬菌体Escherichia phage vB_EcoM_IME392位于同一分支,均属于有尾噬菌体目、长尾噬菌体科。经BLAST比对分析显示,噬菌体EP_H11基因组中共有153个CDSs,其中28个CDSs编码功能蛋白。体外抑菌结果显示,8 h内,EP_H11在MOI为10时表现出良好的抑菌效果。【结论】本研究分离到1株裂解性极强,适应性范围较广,体外抑菌效果良好的噬菌体。该噬菌体具有进一步开发成为大肠杆菌抗菌剂的潜力。

【目的】探究规模化黄鸡孵化场鸡沙门菌流行株的毒力和耐药情况。【方法】采集弱雏卵黄拭子,接种选择培养基分离细菌,挑取疑似菌落进行革兰氏染色镜检,并对沙门菌属特异性基因invA进行PCR扩增鉴定。采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行药敏试验,并通过PCR扩增耐药基因对其进行耐药性分析。利用SPF昆明小鼠对分离株进行致病性试验,并采用PCR法扩增相关毒力基因。【结果】分离菌株中有5株(JSS-Q3、JSS-Q4、JSS-Q5、JSS-Q8和ZJS-C1-11)疑似沙门菌,在伊红-美蓝培养基上形成无色透明的小菌落,在沙门菌显色培养基形成紫色透亮的小菌落,且镜检为短杆状革兰氏阴性菌。沙门菌特异性基因invA PCR扩增阳性,测序比对结果显示与沙门菌相似性达99%;鸡伤寒沙门菌特异性基因(IpaJ) PCR扩增阳性,分离到的5株菌株均为鸡伤寒沙门菌。分离菌株共检出15种毒力基因,其中11种毒力岛基因检出率为100%。耐药性分析表明,5株分离菌株耐药性较强,仅对部分抗菌药敏感,分离菌株对头孢吡肟、氟苯尼考、恩诺沙星表现敏感;另JSS-Q5、JSS-Q8分别对多黏菌素B、新霉素敏感,JSS-Q3对头孢他啶、大观霉素敏感性较好,ZJS-C1-11对头孢克洛、大观霉素以及多黏菌素B敏感性较好。部分菌株携带bla_SHV、bla_TEM、tet (A)、tet (B)等耐药基因。致病性分析发现JSS-Q8和ZJS-C1-11菌株毒性较强,对小鼠具有致死性。【结论】本研究涉及的黄鸡孵化场沙门菌分离株为鸡伤寒沙门菌,均表现多重耐药且部分致病性较强,可能是影响该孵化场孵化率和弱雏率的重要原因之一。研究结果为沙门菌病的检测、诊断及治疗提供一定的试验依据。

【目的】探究四逆汤加减对仔猪腹泻的治疗效果及生长性能、血液生理生化指标和肠道菌群的影响。【方法】选取体重相近的3日龄腹泻仔猪120头,随机分为中药组和西药组,每组60头,另选同群健康仔猪60头为空白对照组。中药组每头仔猪每天灌喂5 g四逆汤加减中药液,连喂7 d;西药组按0.1 mg/kg BW肌内注射庆大霉素,每天1次,连用4 d;空白对照组不做药物处理。给药期间观察并记录仔猪精神状态、采食情况、腹泻情况、平均日增重;给药前后,分别测定仔猪血液生理生化指标及肠道微生物菌群。【结果】用药5 d后,中药组治愈率达97%,显著高于西药组(87%)(P＜0.05),且未出现死亡。治疗结束后,中药组仔猪平均日增重显著高于西药组和空白对照组(P＜0.05)。血常规结果显示,中药组白细胞(WBC)、淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MONO)、中性粒细胞(GRAN)数量及红细胞压积(HCT)均显著高于西药组(P＜0.05);其他血常规指标在各组间均差异不显著(P＞0.05)。血液生化结果显示,中药组丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性均显著低于西药组(P＜0.05),肌酐(CRE)含量显著高于西药组(P＜0.05),各血液生化指标与空白对照组均差异不显著(P＞0.05)。肠道菌群高通量测序结果显示,中药组肠道菌群Simpson、Shannon指数均显著高于西药组(P＜0.05);与西药组相比,中药处理能提高厚壁菌门和拟杆菌门丰度,降低变形杆菌门和梭杆菌门丰度;增加乳杆菌属和梭菌属细菌,减少大肠杆菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属细菌。【结论】四逆汤加减能有效治疗仔猪腹泻,且效果优于西药组,并能有效提高腹泻仔猪生长性能,促进机体损伤的修复,调节肠道菌群结构。

【目的】确定试验滇西树鼩患病致死的原因,分析分离菌株的致病性与耐药情况。【方法】本研究按常规平板划线法对发病死亡的滇西树鼩心脏血、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行病原菌分离,进一步对分离菌进行形态学观察、生化试验及16S rRNA基因鉴定,并进行药敏试验和致病性试验。【结果】从发病死亡的滇西树鼩肝脏和肺脏组织分离得到1株细菌。分离菌在麦康凯培养基上呈浅橘黄色单菌落,镜检为革兰氏阴性短杆菌。生化试验结果显示,分离菌能分解葡萄糖,不发酵乳糖,产气,产硫化氢等,符合沙门氏菌生化特性。遗传进化分析显示,分离株与肉用仔鸡源沙门氏菌CP082916菌株亲缘关系最近,16S rRNA基因核苷酸相似性为99%。药敏试验结果显示,分离菌对氯霉素、庆大霉素、新霉素、诺氟沙星等药物敏感;对克林霉素、万古霉素不敏感。致病性试验结果显示,该菌对树鼩及成年小鼠具有较强致病性,对小鼠的半数致死量(LD₅₀)为1.6×10⁶ CFU。病理组织学观察显示,感染组树鼩和小鼠肺脏肺泡间隔增宽、间隔内可见炎性细胞浸润;肝脏细胞排列紊乱,见大量坏死细胞崩解,窦状隙变形或减小,中央静脉淤血,周围有炎性细胞浸润;脾脏部分细胞结构紊乱。【结论】沙门氏菌是引起这次试验滇西树鼩发病的致死原因,分离菌对氯霉素、庆大霉素、新霉素敏感,具有较强的致病性。