【目的】分析细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)2个Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因EGR-07243和EGR-07244的生物信息学特性,并进行原核表达,以期检测EGR-07243和EGR-07244蛋白的免疫原性。【方法】利用PCR扩增EGR-07243、EGR-07244基因全长序列,采用生物信息学软件对EGR-07243、EGR-07244蛋白的理化性质、结构特点及亲缘进化关系进行分析;构建重组质粒pET32a-EGR-07243、pET32a-EGR-07244并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,并通过Western blotting对蛋白进行抗原性分析。【结果】EGR-07243基因全长228 bp,编码75个氨基酸,蛋白分子式为C₆₈₆H₁₁₄₆N₂₂₈O₂₉₂S₆₃,相对分子质量约19258,含有3个B细胞抗原表位,理论等电点为5.30,脂肪系数为17.98,亲水性为0.714,为稳定蛋白;EGR-07244基因全长228 bp,编码75个氨基酸,蛋白分子式为C₆₇₅H₁₁₂₄N₂₂₈O₂₈₇S₅₆,相对分子质量约18800,含有3个B细胞抗原表位,理论等电点为5.32,脂肪系数为20.61,亲水性为0.689,为稳定蛋白。二者氨基酸序列相似性为72.00%。二者与绦虫属的功能结构域氨基酸序列一致性为95%以上,亲缘关系极近;而与人的功能结构域氨基酸序列一致性为46.3%,亲缘关系较远。通过双酶切鉴定及测序分析证明,pET32a-EGR-07243、pET32a-EGR-07244重组质粒构建成功。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后成功诱导表达蛋白,Western blotting结果显示,2种蛋白能被感染原头蚴的犬阳性血清识别且不被健康犬血清识别,表明其均具有良好的反应原性。【结论】EGR-07243和EGR-07244蛋白能够作为预防细粒棘球绦虫感染的疫苗免疫靶点,结果为抗包虫病疫苗候选分子的筛选提供了试验材料。

【目的】筛选牦牛卵泡发育过程中可能对靶向Smad家族成员4(Smad family member 4,Smad4)基因的bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。【方法】使用miRanda和RNAhybrid数据库对靶向牦牛bta-miR-146a的lncRNA进行预测;采集牦牛卵巢,分离健康、闭锁卵泡,用Trizol法提取RNA并反转录为cDNA,利用PCR检测所预测lncRNA的表达情况;利用实时荧光定量PCR法检测所筛选lncRNA和bta-miR-146a/Smad4在牦牛健康、闭锁卵泡中的表达情况;构建lncRNA-ENSBGRT00000000387.1的野生型和突变型双荧光素酶载体,将其与bta-miR-146a-mimics、mimics NC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。【结果】试验共筛选出7个可能对靶向Smad4基因的bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用的lncRNAs,其中的lncRNA-ENSBGRT00000000387.1在牦牛卵泡中表达量极显著高于其他lncRNAs(P＜0.01)。实时荧光定量PCR检测发现,lncRNA-ENSBGRT00000000387.1、bta-miR-146a和Smad4基因mRNA在牦牛健康和闭锁卵泡中共表达,且lncRNA-ENSBGRT00000000387.1和Smad4基因mRNA在牦牛健康卵泡中的表达量均显著高于闭锁卵泡(P＜0.05),bta-miR-146a在牦牛健康卵泡中的表达量极显著低于闭锁卵泡(P＜0.01)。试验成功构建牦牛lncRNA-ENSBGRT00000000387.1野生型及突变型pmirGLO双荧光素酶报告质粒,双荧光素酶活性结果显示,bta-miR-146a mimics对牦牛lncRNA-ENSBGRT00000000387.1-WT具有极显著下调作用(P＜0.01)。【结论】lncRNA-ENSBGRT00000000387.1、bta-miR-146a和Smad4基因mRNA可能在牦牛卵泡发育或闭锁过程中存在调控机制,并在体外初步证实lncRNA-ENSBGRT00000000387.1与bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用,这为进一步研究lncRNA-ENSBGRT00000000387.1在牦牛卵泡中的功能机制提供依据。

【目的】扩增奶牛隐花色素昼夜节律调节因子1(cryptochrome circadian regulator 1,CRY1)基因全长编码区(coding sequence,CDS),构建该基因的真核表达载体并对其进行生物信息学分析,检测奶牛CRY1基因的表达谱,为后续探究CRY1蛋白的生物学功能提供参考。【方法】以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增CRY1基因CDS区,将其与酶切线性化的pcDNA3.1-3HA空质粒以同源重组法连接,重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-cCRY1;利用在线软件对奶牛CRY1基因进行生物信息学分析。将空质粒pcDNA3.1-3HA和重组质粒pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染至HEK293T细胞,利用Western blotting技术检测奶牛CRY1基因在蛋白水平的表达;利用实时荧光定量PCR检测CRY1基因在奶牛不同组织中的表达量。【结果】试验成功获得1764 bp的奶牛CRY1基因CDS区序列,且成功构建pcDNA3.1-3HA-cCRY1真核表达载体。奶牛CRY1基因与牦牛、山羊、绵羊相似性在98%以上,且遗传距离较近。生物信息学分析表明,CRY1蛋白为碱性、亲水性蛋白,无跨膜结构与信号肽,存在45个潜在磷酸化位点,与CLOCK、ARNTL、FBXL3等多个蛋白存在互作。Western blotting结果表明,pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染组在72 ku处出现明显的条带,而pcDNA3.1-3HA转染组在相应位置处无条带。实时荧光定量PCR结果表明,CRY1基因在奶牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏等10个组织中均有表达,其中在心脏中的表达量最高,在颈斜方肌中的表达量最低。【结论】本研究成功构建了CRY1基因的真核表达载体,且在HEK293T细胞中实现了CRY1蛋白的过表达。CRY1蛋白是一种不稳定的胞内蛋白,可与多种蛋白互作,并参与昼夜节律调控、细胞代谢、糖异生等过程。CRY1基因在牛、羊等反刍动物间较为保守,在奶牛多种组织中均有表达。研究结果为深入探究CRY1蛋白在奶牛生物钟系统中的转录调控机制提供参考依据。

【目的】研究miR-192的生物进化进程和潜在靶基因功能,以及miR-192在大围子猪(脂肪型猪)和大约克夏猪(瘦肉型猪)脂肪组织中的差异表达。【方法】利用miBase数据库获取miR-192成熟序列,并利用Ensembl数据库定位miR-192在不同物种基因组的分布特征;采用Mega 11.0软件程序构建miR-192系统进化树;通过实时荧光定量PCR检测miR-192在大围子猪和大约克夏猪背部脂肪组织中的表达情况,并比较表达差异;利用不同在线网站预测猪miR-192靶基因,并对靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。【结果】miR-192在生物进化过程中具有高度保守性;实时荧光定量PCR结果显示,miR-192在大围子猪背部脂肪组织的表达量极显著高于大约克夏猪(P＜0.01));GO功能和KEGG通路富集分析结果表明,miR-192靶基因主要起转录前调节和结合的作用,且主要在染色质和细胞核中发挥作用,多数基因富集在与脂肪代谢相关的信号通路;对3个网站不同物种预测结果取交集共获得猪miR-192保守靶基因5个。【结论】miR-192在生物进化过程中具有高度保守性,可能通过靶向调节靶基因的表达,从而在猪脂肪组织分化中起作用,为进一步探讨miR-192在脂肪组织分化中的调控机制提供理论基础。

【目的】本研究旨在解析肌细胞生成素(MyoG)基因启动子区序列的结构特性及其转录调控机制。【方法】以贵州白山羊血液基因组DNA为模板,设计2对引物,采用PCR扩增、Sanger测序技术获得MyoG基因启动子区序列,通过DNAStar和Mega 5.0软件分别进行不同物种MyoG基因启动子区序列相似性比对及系统进化树构建,利用生物信息学软件预测分析该序列核心启动子区、转录因子结合位点、顺式作用元件、CpG岛等结构特征。【结果】贵州白山羊MyoG基因启动子区序列长2334 bp,包括2092 bp的5'-侧翼序列和242 bp的外显子1,GC含量略低于AT含量。通过不同物种比对分析,贵州白山羊MyoG基因启动子区序列与绵羊、牛、猪、人、小鼠和鸡同源序列相似性分别为98.34%、96.15%、77.76%、74.15%、57.63%和43.04%。系统进化树结果表明,贵州白山羊与绵羊和牛的亲缘关系较近,与鸡的亲缘关系最远。生物信息学结构预测发现,贵州白山羊MyoG基因转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游50 bp,5'-侧翼区存在1个潜在的启动子区域和1个CpG岛,含有1个TATA-box(TTTAAATG)、1个GC-box(CCGCCC)、2个CAAT-box(CCAAT)、17个E-box(CANNTG)和1个富含A/T碱基的元件结构(TATATTTAT)。AliBaba 2.1、PROMO、Patch 1.0、JASPAR²⁰²²和AnimalTFDB 3.0在线软件综合预测发现,贵州白山羊MyoG基因启动子区存在Sp1、NF-1、MEF2、MyoD、USF、GATA-1、GATA-3、SRF、C/EBP和c-Myb等多种转录因子潜在结合位点。【结论】本研究成功克隆获得贵州白山羊MyoG基因启动子区序列,为深入解析该基因调控山羊肌肉发育的分子机制提供理论依据。

【目的】研究鸭胸肌脂质谱,并探究北京鸭和连城白鸭胸肌脂质组差异。【方法】选取6周龄北京鸭和连城白鸭各28只并采集其胸肌组织,采用基于液相色谱-质谱联用方法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)的脂质组学技术检测鸭胸肌中的脂质谱,通过多变量统计分析方法对北京鸭和连城白鸭胸肌脂质组的检测结果进行分析,采用差异倍数、t检验和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)筛选差异脂质。【结果】鸭胸肌共被鉴定到950种脂质,涵盖6大类,即甘油磷脂类(GP)395种、甘油脂类(GL)365种、鞘脂类(SP)86种、脂肪酰类(FA)78种、甾醇脂类(ST)23种、异戊烯醇脂类(PR)3种;种类含量最多的脂质亚类为甘油三酯类(TG)283种。与北京鸭相比,连城白鸭中筛选到18种差异显著脂质:7个上调,11个下调;其中TG类最多且在北京鸭中含量高,同时这些TG富含饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸,而含超长链多不饱和脂肪酸(VLC-PUFA)的GP在连城白鸭中含量高。【结论】本研究获得了全面详细的鸭胸肌脂质谱,并筛选出了北京鸭和连城白鸭18种差异脂质标记物,为鸭的肌内脂质代谢、肉质研究及品质育种提供了科学的理论依据。

【目的】通过超高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS/MS)代谢组学技术分析归芪益母口服液对产后奶牛血浆代谢物的影响,以阐明归芪益母口服液对产后奶牛的保健机制。【方法】选取15头体况相近、2~3胎健康待产荷斯坦奶牛,随机分为对照组(n=7)和试验组(n=8),分别在产后立即灌服饮用水和归芪益母口服液,500 mL/头,连续灌服6 d。产后7 d晨饲前采血,经预处理后采用UPLC-MS/MS上机检测,利用MetaboAnanlyst 5.0软件筛选VIP≥1、P＜0.05的差异代谢物进行代谢通路富集分析。【结果】产后7 d,试验组血浆代谢轮廓较对照组发生明显改变,筛选出16种差异代谢物,其中8种显著上调,包括蛋氨酸亚砜、磷酸肌酸、甘油磷酸胆碱、皮质醇、L-色氨酸、溶血磷脂酰胆碱(18∶2)、五羟色胺和L-精氨酸;8种显著下调,包括1-氨基环己酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸、L-天冬酰胺、单酰甘油酯酰基(16∶1)、泛酰巯基乙胺、十八碳单烯酰胺、1-甲基鸟嘌呤和3-N-甲基-L-组氨酸。差异代谢物显著富集在甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢通路。【结论】归芪益母口服液对产后奶牛具有保健作用,可能与其调节甘油磷脂代谢、皮质醇代谢、色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢从而发挥抗炎、抗氧化、调节食欲及肠道菌群稳态、缓解能量负平衡作用有关。

胆汁酸不仅有助于消化和营养吸收,近年来还被证实是一种信号分子,可通过激活相应受体参与调节多种生理功能,如脂质代谢、葡萄糖代谢和能量代谢等。肠脑轴是胃肠道和中枢神经系统共同构成的双向信号系统,不仅能整合肠道和中枢神经系统功能,还能将两者有机联系起来。胆汁酸和肠道存在一定的相互作用,其中肠道微生物是两者相互作用的关键因素,也是肠脑轴的重要因素。不同浓度的胆汁酸对肠道的影响有差异,其对肠道的影响主要体现在对肠道微生物的影响上,同样,肠道对胆汁酸的作用大部分也体现在肠道微生物。目前相关研究多集中于胆汁酸和肠道微生物的相互影响。此外,在大脑中也发现了胆汁酸和胆汁酸受体,这说明胆汁酸可能在中枢神经系统中发挥一定的生理作用。胆汁酸可通过直接或间接途径向中枢神经系统发出信号,从而影响大脑各项功能。各种肠道激素、迷走神经和胆汁酸受体都参与了这个过程,其中胆汁酸受体发挥了不可忽视的作用。越来越多研究表明,胆汁酸、大脑、肠道及肠道微生物间存在复杂的相互作用,胆汁酸可能是肠道和大脑间直接沟通渠道之一,对肠脑轴有潜在影响。笔者综述了胆汁酸及其受体在肠道和大脑中的影响,介绍了肠脑轴中胆汁酸功能的研究进展。

【目的】研究不同冷应激复温后对ICR小鼠的自发运动、探索行为、焦虑情绪和血液激素指标的影响。【方法】通过与28 ℃常温对照组相比,检测ICR小鼠4、10、16、22 ℃冷应激复温组于复温2、4、6、8、10、12 h后在旷场试验和高架十字迷宫试验中的运动变化,并通过ELISA检测各组在复温2及4 h后的血液激素指标变化。【结果】旷场试验结果显示,与28 ℃常温对照组相比,22 ℃冷刺激复温10 h时中央区域停留时间和运动时间显著减少(P＜0.05);16 ℃冷刺激复温4和8 h时中央区域停留时间显著减少(P＜0.05);10 ℃冷刺激复温4和10 h时中央区域停留时间显著减少(P＜0.05),复温2 h中央区域运动距离显著增加(P＜0.05);4 ℃冷刺激复温6 h时中央区域停留时间极显著减少(P＜0.01),复温2 h中央区域运动距离极显著增加(P＜0.01)。高架十字迷宫试验结果显示,与28 ℃常温对照组相比,22和4 ℃冷刺激复温4 h、16 ℃冷刺激复温10 h闭臂停留时间显著或极显著下降(P＜0.05; P＜0.01);10 ℃冷刺激复温组闭臂停留时间无显著变化(P＞0.05)。与28 ℃常温对照组相比,皮质酮(CORT)在22 ℃冷刺激复温4 h时极显著升高(P＜0.01),16 ℃冷刺激复温2和4 h时极显著升高(P＜0.01);肾上腺素(EPI)在22 ℃冷刺激复温4 h时极显著升高(P＜0.01),10 ℃冷刺激复温2和4 h时极显著升高(P＜0.01)。【结论】冷应激结束后对ICR小鼠的自发运动、探索行为、焦虑情绪和血液激素指标存在持续影响,应减少以ICR小鼠为模型的试验环境温度变化,提高试验结果准确性。

溶菌酶是一种天然抗菌剂,能直接水解细菌细胞壁发挥抑菌作用,但溶菌酶仅对革兰氏阳性菌有抑菌活性的特性限制了其在食品和养殖业中的应用。溶菌酶是一种小分子蛋白质,越来越多的研究通过对溶菌酶进行改造和修饰提高了其抑菌活性并扩大了抑菌谱。笔者主要综述了溶菌酶在使用温度、pH、金属离子、化学修饰、与纳米材料结合、与其他溶液复配和利用基因工程技术等条件改造后,抑菌活性均有不同程度的提高,特别是提高了对革兰氏阴性菌的抑制活性。可通过以下几种改造方式提高溶菌酶的抑菌活性:①通过升高温度破坏酶分子内的非共价结合;②通过降低pH影响酶的分子空间结构;③加入金属离子;④对酶分子侧链基团或化学基团进行化学修饰;⑤使用纳米材料负载溶菌酶并固定制成纳米复合材料以破坏细胞壁;⑥利用溶菌酶和其他抑制细菌生长的溶液进行混合制得复合液;⑦使用基因重组技术构建新的溶菌酶表达载体。研究改造溶菌酶对于基础科学的发展及溶菌酶替代抗生素应用于水产和畜禽养殖、开发绿色天然食品防腐剂具有重要指导意义。

【目的】探讨放牧条件下补充酵母硒对绵羊胃肠道微生物区系的影响。【方法】选择体重相近、健康的7~8月龄杜泊寒羊14只,采用单因素完全随机试验设计分成两组,每组7只。一组为对照组,不添加硒,另一组为硒添加组,硒(酵母硒)添加水平为0.2 mg/d。在自然放牧条件下进行为期30 d的饲养试验,分别于试验第15和30天采集瘤胃液和粪样,采用16S rRNA测序方法分析绵羊瘤胃以及后肠道微生物区系的变化。【结果】主坐标分析结果表明,补硒第30天后两组绵羊瘤胃及后肠道微生物在OTU和属水平上具有显著的组间差异(P＜0.05)。物种差异判别分析结果表明,饲养第15天时在门和属水平有8种瘤胃微生物具有显著的组间差异(P＜0.05),但这些物种的丰度均低于1%;饲养第30天时在门和属水平上有17种瘤胃微生物具有显著的组间差异(P＜0.05),其中相对丰度大于1%的有厚壁菌门、拟杆菌门、普雷沃氏菌属1、瘤胃球菌科NK4A214、拟杆菌目BS11;与对照组相比,硒添加组瘤胃中厚壁菌门、瘤胃球菌科NK4A214、拟杆菌目BS11的相对丰度显著提高(P＜0.05),拟杆菌门、普雷沃氏菌属1的相对丰度显著降低(P＜0.05)。饲养第15天时在属水平上有5种后肠道微生物具有显著的组间差异(P＜0.05),但这些物种的丰度均低于1%;饲养第30天时在门和属水平上有18种后肠道微生物具有显著的组间差异(P＜0.05),其中相对丰度大于1%的有厚壁菌门、拟杆菌门、拟杆菌属、瘤胃球菌科UCG-009、UCG-010、UCG-013和NK4A214、未排位的瘤胃球菌科、毛螺菌科AC2044、norank_f_Muribaculaceae;与对照组相比,硒添加组后肠道中拟杆菌门、拟杆菌属、瘤胃球菌科UCG-010和UCG-013的相对丰度显著提高(P＜0.05),厚壁菌门、毛螺菌科AC2044、瘤胃球菌科NK4A214和UCG-009、未排位的瘤胃球菌科、norank_f_Muribaculaceae的相对丰度显著降低(P＜0.05)。【结论】放牧条件下补充酵母硒可提高绵羊瘤胃微生物多样性和后肠道微生物丰富度,瘤胃中纤维降解菌的数量增加,后肠道中蛋白质和可溶性多糖降解菌的丰度提高。此外,放牧条件补饲酵母硒可促进绵羊后肠道益生菌的生长并抑制有害微生物的生长。

【目的】探究持续育肥后期安格斯公牛适宜的饲粮综合净能(NEmf)需要量。【方法】采用单因素完全随机试验设计,选取月龄(18.3±1.0)和体重((503.3±21.1)kg)相近的安格斯公牛30头,随机分成3组:低能组(LE组)、中能组(ME组)和高能组(HE组),每组10头牛,每头牛为1个重复,分前期(500~600 kg)和后期(600~700 kg)2个阶段饲喂,前期饲粮综合净能分别为6.64、6.84、7.04 MJ/kg,后期分别为6.84、7.04、7.24 MJ/kg,前、后期饲粮蛋白质水平均为11.42%。试验预饲期10 d,正试期130 d。每期试验开始和结束当天晨饲前称重,测定安格斯公牛生长性能、体尺指标,并于尾根静脉采集血液样品,测定血清生化指标;试验结束后将全部牛屠宰,测定屠宰性能;根据饲料成本和增重效益,计算经济效益。【结果】①试验前期和后期,中、高能组安格斯公牛总增重和平均日增重均显著高于低能组(P＜0.05),料重比显著低于低能组(P＜0.05)。②试验前期,高能组安格斯公牛血清甘油三酯含量显著高于低能组(P＜0.05);饲粮能量水平对终末体重和平均干物质采食量没有显著影响(P＞0.05);经济效益以高能组最佳。③试验后期,中、高能组安格斯公牛终末体重显著高于低能组(P＜0.05);高能组平均干物质采食量、胸围和腹围显著高于低能组(P＜0.05);经济效益以中能组最佳。④中、高能组安格斯公牛宰前活重和肾周脂肪重显著高于低能组(P＜0.05);高能组胴体重和背膘厚显著高于低能组(P＜0.05)。⑤饲粮能量水平对安格斯公牛血清葡萄糖、尿素氮含量及屠宰率和眼肌面积没有显著影响(P＞0.05)。【结论】适当提高饲粮能量水平可以维持机体正常能量代谢,提高安格斯公牛的育肥效益。综合分析得出,持续育肥后期安格斯公牛适宜的饲粮能量(综合净能)水平为7.04 MJ/kg。

运输是贯穿家禽生产到屠宰期间的重要环节。随着消费者对禽产品需求量的增长,家禽养殖业得到快速发展,家禽运输越来越频繁,由此产生的家禽运输应激也备受关注。运输应激是指运输过程中家禽受到各种应激原的刺激,如饥饿、口渴、气候、拥挤、噪音、振动、混群、体力消耗、运输持续时间和病原菌入侵等综合作用的结果,引起运输应激综合征。运输应激会导致家禽生产性能下降甚至死亡,引起家禽神经内分泌、免疫和能量供应系统功能异常,造成机体组织发生损伤,肉品质变差,还会诱发肠道氧化应激,导致肠道菌群紊乱,破坏肠道健康,进而影响家禽的生长发育及健康状况,不仅损害家禽福利,也给家禽业带来严重经济损失和资源浪费。可通过缩短运输时间、给予宰前休息、控制密度、防寒降温、以及补充中草药与植物提取物、微量元素和其他功能性添加剂等措施缓解家禽运输应激。笔者综述了运输应激对家禽生产性能、内分泌与免疫性能、肉品质与肠道健康等方面的影响,以及缓解家禽运输应激的相关措施,以期为家禽运输应激研究及其缓解调控提供重要的参考依据。

【目的】试验旨在研究黄芩(SBG)对玉米赤霉烯酮(ZEA)暴露幼龄雌性小鼠抗氧化能力、性激素水平及雌性生殖器官中雌激素受体α(ERα)和孕酮受体(PR)基因表达的影响。【方法】试验选取50只雌性小鼠,预饲1周后随机分为5组,每组10只。对照组(CK)灌胃10 mL/kg玉米油、ZEA组灌胃20 mg/kg ZEA、ZEA＋SBG10组灌胃20 mg/kg ZEA+10 g/kg SBG、ZEA＋SBG20组灌胃20 mg/kg ZEA+20 g/kg SBG、ZEA＋SBG30组灌胃20 mg/kg ZEA+30 g/kg SBG。所有试验小鼠均饲喂基础饲粮,正试期3周。正试期间每日记录小鼠体重;分别在试验的第1、2和3周末晨饲前采集小鼠尾静脉血样,检测血清中抗氧化相关指标和性激素含量;在试验第3周末,采集卵巢和子宫,检测相关类固醇激素受体基因mRNA的表达。【结果】与CK组相比,ZEA暴露2周以上可引起雌性小鼠体重、血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、谷胱甘肽(GSH)和雌二醇(E₂)含量均显著降低(P＜0.05);卵巢刺激素(FSH)水平显著增加(P＜0.05),而黄体生成素(LH)水平无显著变化(P＞0.05)。与ZEA组相比,20和30 g/kg SBG处理3周均显著提升小鼠体重(P＜0.05),20 g/kg SBG处理3周显著升高血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)、GSH-Px活性及GSH水平(P＜0.05),30 g/kg SBG处理2周后这3项指标均显著提高(P＜0.05);20和30 g/kg SBG处理2周显著降低血清丙二醛(MDA)含量(P＜0.05);30 g/kg SBG处理2周可显著增加血清E₂水平(P＜0.05),显著降低FSH含量(P＜0.05);20和30 g/kg SBG处理3周后小鼠子宫和卵巢ERα基因表达显著提升(P＜0.05),但PR的mRNA表达量在各组之间差异不显著(P＞0.05)。【结论】SBG可通过提高ZEA暴露雌性小鼠血清抗氧化能力及性激素水平,增强子宫及卵巢ERα的表达,缓解ZEA造成的氧化损伤和生殖毒性,SBG推荐剂量为20~30 g/kg。

【目的】试验旨在探究在保健砂中添加不同浓度包被丁酸钠对种鸽和乳鸽的生长性能、屠宰性能及免疫器官指数的影响。【方法】试验选取6月龄家鸽336只,随机分成4组,每组7个重复,每个重复12只,乳鸽由种鸽自然孵化,每对种鸽哺育2只乳鸽。对照组种鸽饲喂保健砂,A、B、C组分别在保健砂中添加0.1%、0.2%、0.4%包被丁酸钠。种鸽试验期120 d,乳鸽试验期28 d。称量种鸽和乳鸽的初重和末重,统计种鸽饲料消耗情况,并进行生长性能计算;试验结束后,每组选5只种鸽和5只乳鸽屠宰后称取屠体重、胸肌重、腿肌重、半净膛重和全净膛重,并计算屠宰性能;称取乳鸽胸腺、脾脏和法氏囊以及种鸽胸腺、脾脏,计算免疫器官指数;取种鸽十二指肠内容物,测定淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性。【结果】①试验A、B组种鸽哺乳期的平均日增重显著高于对照组和试验C组,且试验A组10月龄种鸽采食量显著高于对照组(P＜0.05),B、C组乳鸽的平均日增重显著高于对照组和试验A组(P＜0.05)。②与对照组相比,试验A、B组种鸽半净膛率、全净膛率以及试验A、B、C组乳鸽半净膛率、全净膛率、屠宰率均显著提高(P＜0.05)。③各组间种鸽胸腺指数和脾脏指数差异不显著(P＞0.05)。试验B组乳鸽胸腺指数显著高于试验C组,而法氏囊指数显著低于试验C组(P＜0.05)。④与对照组相比,试验C组种鸽十二指肠胰蛋白酶活性显著升高(P＜0.05),试验B、C组脂肪酶活性显著升高(P＜0.05)。【结论】种鸽保健砂中添加包被丁酸钠可以提高种鸽及乳鸽平均日增重以及种鸽平均采食量,提高乳鸽屠宰性能以及免疫能力,提高种鸽十二指肠胰蛋白酶活性以及脂肪酶活性。本试验条件下,种鸽保健砂中添加0.2%包被丁酸钠效果最佳。

【目的】研究和厚朴酚(honokiol,HNK)对镉(Cd)暴露引起动物肾脏损伤的保护作用。【方法】选取48只体重相近(61.05 g±2.00 g)、健康状况良好的1日龄三黄鸡随机分为4组,每组3个重复,每个重复4只。对照组饲喂基础饲粮,Cd组在基础饲粮中添加70 mg/kg氯化镉,HNK组在基础饲粮中添加400 mg/kg HNK,联合处理组(HNK+Cd组)在基础饲粮中添加70 mg/kg氯化镉和400 mg/kg HNK,试验期30 d。【结果】与对照组相比,Cd组鸡肾脏中Cd含量、血清中尿酸(uric acid,UA)及肌酐(creatinine,CREA)含量均极显著升高(P＜0.01),肾脏肾小囊腔隙增大,凋亡细胞数增多,肾组织中硒(Se)、铁(Fe)、锰(Mn)含量均极显著降低(P＜0.01),锌(Zn)、铜(Cu)含量均极显著升高(P＜0.01);HNK组鸡肾脏Zn、Fe含量极显著或显著升高(P＜0.01;P＜0.05),Cd、Se、Cu、Mn含量及血清UA、CREA含量均无显著差异(P＞0.05)。与Cd组相比,HNK+Cd组鸡肾脏Cd、Cu、血清UA含量均显著降低(P＜0.05),CREA含量下降但差异不显著(P＞0.05),肾脏中Se、Zn、Fe、Mn含量显著升高(P＜0.05),肾小管细胞损伤得到缓解、凋亡细胞数量有所减少。【结论】HNK可降低Cd在肾脏中的蓄积,减少肾脏组织凋亡细胞数,并缓解肾脏组织损伤,改善鸡体内微量元素代谢紊乱情况,增强鸡体质。

益生菌是一类有助于动物机体健康的微生物,在提高机体免疫力、改善肠道微生物平衡、促进养殖场环境等方面发挥重要作用。近年来,国内外学者对基因工程技术的探索已逐步深入,并在实际生产中加以应用。但是,目前为止绝大多数的研究将基因编辑技术着眼于真核生物。在此基础上,如何将基因编辑技术应用于益生菌,使益生菌发挥出更大的潜力是当前的研究热潮。因此通过基因工程技术将特定基因与益生菌进行基因编辑并表达,编辑后的益生菌可以表达特定的基因或者靶向对宿主发挥免疫调节作用。作者总结了基因编辑后的益生菌与宿主的相互作用,综述了CRISPR-Cas9技术在基因编辑乳酸菌及畜牧生产上的应用,同时经过分析比较不同基因编辑技术对乳酸菌进行基因编辑的方法,发现CRISPR-Cas9技术是目前针对乳酸菌和双歧杆菌等食品级益生菌相对灵活的基因编辑工具,能够实现益生菌在宿主体内发挥多重健康功效的目的,并对未来CRISPR-Cas9技术在基因编辑乳酸菌中的应用进行了展望,认为未来应将CRISPR-Cas9技术和其他基因编辑方法相结合,探索出更快更高效、简便的益生菌基因编辑技术。

【目的】探究RNA甲基化转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells,BSMSCs)增殖和成肌分化的影响。【方法】利用体外诱导BSMSCs分化模型模拟牛骨骼肌生长发育过程,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测METTL3在BSMSCs分化前后mRNA和蛋白表达水平的差异。设计合成METTL3干扰RNA(si-METTL3),且构建METTL3的过表达载体pcDNA3.1-METTL3,分别转染至BSMSCs中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测转染效果和BSMSCs增殖标志因子盒转录家族成员7(paired box 7,Pax7)的表达情况,EdU检测细胞增殖情况。将转染si-METTL3和pcDNA3.1-METTL3的BSMSCs进行体外诱导分化,通过光学显微镜观察BSMSCs进入分化期的细胞形态,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测BSMSCs分化标志因子肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)、肌细胞生成素(myogenin,MyoG)的表达情况。通过比色法检测干扰或过表达METTL3后,BSMSCs不同时期的m⁶A RNA甲基化水平。【结果】BSMSCs分化后METTL3蛋白表达水平极显著高于增殖期(P＜0.01);干扰或过表达METTL3后,Pax7的mRNA水平以及蛋白水平均无显著变化(P＞0.05),EdU阳性细胞率与对照组相比均无显著差异(P＞0.05);干扰METTL3后,细胞肌管数量明显增多,肌管直径明显增大,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著升高(P＜0.01),MyoG的蛋白表达水平极显著升高(P＜0.01),并且BSMSCs增殖和分化期的m⁶A RNA甲基化水平均极显著下调(P＜0.01);过表达METTL3后,细胞肌管数量明显减少,肌管直径明显变小,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01),MyoG的蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01),并且BSMSCs增殖和分化期的m⁶A RNA甲基化水平均极显著上升(P＜0.01)。【结论】METTL3对BSMSCs的增殖过程没有显著影响,但对BSMSCs的成肌分化过程具有调控作用,并影响BSMSCs的m⁶A RNA甲基化水平。干扰METTL3可以促进BSMSCs的成肌分化进程,降低BSMSCs的m⁶A RNA甲基化水平;而过表达METTL3会抑制BSMSCs的分化,提高BSMSCs的m⁶A RNA甲基化水平。试验结果为进一步探明METTL3在牛肌肉发育中的调控机制奠定了基础。

【目的】通过对内蒙古白绒山羊4个多胎性状相关基因进行测序和生物信息学分析,深入挖掘与产羔数显著相关的单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,为提升绒山羊高效繁育提供理论依据。【方法】选取阿拉善型、阿尔巴斯型绒山羊母羊244只,利用MultipSeq多重PCR结合二代高通量技术检测生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)、骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B(bone morphogenetic protein receptor 1B,BMPR1B)和β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2,B4GALNT2)基因多态性,并对不同SNP位点与绒山羊产羔数进行关联分析。【结果】通过GATK分析共预测得到172个SNPs位点,其中BMPR1B、B4GALNT2、BMP15、GDF9基因相关SNPs位点分别为95、33、26和18个。GLM模型关联分析发现,10个SNPs位点与白绒山羊产羔数显著相关(P＜0.05),进一步进行卡方检验发现,其中7个SNPs位点基因型与产羔数显著相关(P＜0.05)。BMPR1B基因g.29893723 C＞G、g.29897064 G＞A、g.29897722 G＞A、g.29897734 C＞A和g.29938673 C＞G位点的CC、GG、GA、CA和CC基因型个体产羔数分别显著高于CG、GA、GG、CC和GG基因型(P＜0.05);B4GALNT2基因g.37072289 G＞A位点的GG和GA基因型个体产羔数均显著高于AA基因型(P＜0.05);GDF9基因g.66027842 A＞C位点的CC和AC基因型个体产羔数均显著高于AA基因型(P＜0.05)。【结论】试验获得了内蒙古白绒山羊多胎性状相关基因GDF9、BMP15、BMPR1B和B4GALNT2的SNPs位点序列特征,发现了与白绒山羊产羔数显著相关的10个SNPs位点,并揭示了不同基因型产羔数间的差异,从而为内蒙古白绒山羊分子辅助育种提供了有力的SNP参考位点。

【目的】试验旨在克隆多浪羊神经元正五聚体蛋白1(neuronal pentraxin 1,NPTX1)基因CDS序列,利用生物信息学分析NPTX1蛋白的结构和功能,并研究其在多浪羊初情期启动过程中性腺轴不同组织中的表达规律。【方法】采集初情期前、初情期、初情期后健康雌性多浪羊的下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫组织,提取总RNA并反转录成cDNA,以初情期前下丘脑cDNA为模板,PCR扩增多浪羊NPTX1基因并克隆测序,对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析NPTX1基因在多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、子宫、输卵管5个组织中的表达水平。【结果】克隆得到NPTX1基因长1576 bp,其中CDS区序列为1299 bp,与GenBank上预测的绵羊mRNA序列(登录号:XM_005683183.3)相似性达99.85%。系统进化树分析得出,多浪羊NPTX1基因与绵羊的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析发现,NPTX1蛋白为不稳定的亲水性酸性蛋白,具有1个信号肽,属于分泌蛋白;二级结构中α-螺旋和无规则卷曲占比分别为41.90%和40.73%,与三级结构预测结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,NPTX1基因在多浪羊3个时期5个不同性腺组织中均有表达,在初情期下丘脑中表达量最高,显著高于初情期前和初情期后(P＜0.05)。【结论】试验成功克隆了多浪羊NPTX1基因CDS全长序列,并揭示了NPTX1基因在多浪羊初情期不同阶段性腺轴组织中的表达差异性,为进一步探究NPTX1基因在多浪羊初情期启动过程中的调控机制提供依据。

褐色脂肪细胞的结构和功能都与白色脂肪不同,其细胞富含线粒体,能够利用过剩的能量代谢底物进行产热,是幼龄哺乳动物非颤抖性产热的主要热量来源,在维持机体能量平衡方面具有重要作用。其产热过程由细胞线粒体内膜上的解偶联蛋白1(UCP1)介导,机体所处环境以及对激素的响应都可以影响褐色脂肪的活性。受到刺激后,褐色脂肪细胞表面的肾上腺素受体得到激活,激发细胞内的级联反应,同时使产热相关基因表达增强,增加能量消耗,减少脂肪沉积。褐色脂肪已经成为治疗肥胖以及能量代谢相关疾病的潜在靶点。鉴于褐色脂肪在脂肪沉积以及能量代谢方面的作用,关于畜禽褐色脂肪的研究也越来越深入。作者归纳了绵羊褐色脂肪的相关研究,主要包括影响绵羊褐色脂肪活性的环境因素如冷刺激、营养限制、长期缺氧和饲喂添加剂,以及激素因子(催乳素及其受体、甲状腺激素、瘦素、生殖激素),以期为绵羊产热脂肪的应用研究提供一定的理论依据。

【目的】筛选更安全高效的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)合成肽疫苗佐剂。【方法】将IMS 251C VG、GEL 02 PR、ISA 15A VG、ISA 206 VG、ISA 61 VG、台湾细菌鞭毛、卡波姆、多糖共8种佐剂与适量PCV2多肽抗原按照特定方法配制成不同疫苗,并验证其物理性状,采用小鼠试验初步检验疫苗安全性及免疫效果,筛选出较优的佐剂进行仔猪免疫攻毒保护试验,进一步评估各疫苗的免疫保护效果。【结果】物理性状显示,所有疫苗稳定性均较好,4 ℃保存期均超过12个月。ISA 61 VG油佐剂黏度较高且乳滴粒径较大,ISA 15A VG、ISA 206 VG双相佐剂次之,其余水佐剂均较低较小。小鼠试验结果显示,除台湾细菌鞭毛佐剂外其他佐剂安全性均良好;小鼠ELISA抗体水平检测结果显示,ISA 61 VG、GEL 02 PR、ISA 206 VG组免疫效果明显高于其余疫苗组;综合评定安全性和免疫效果,筛选ISA 61 VG、GEL 02 PR、卡波姆、多糖、ISA 206 VG共5个佐剂组进行仔猪免疫攻毒保护试验。仔猪免疫攻毒保护试验结果显示,免疫后,ISA 61 VG和GEL 02 PR组保护效果明显优于其他佐剂,其制备的疫苗产生的ELISA抗体和中和抗体水平均明显高于其他组,同时还可刺激产生更高水平的细胞因子γ-干扰素(IFN-γ);攻毒后,ISA 61 VG、GEL 02 PR、ISA 206 VG组疫苗的仔猪相对日增重显著高于其他佐剂组(P＜0.05),且实时荧光定量PCR和免疫组化结果显示,上述疫苗组可显著降低仔猪体内病毒载量(P＜0.05)。临床症状观察显示,ISA 61 VG和GEL 02 PR疫苗组无体温升高或被毛粗乱等现象,病理切片表明这2个疫苗组组织病变较轻。【结论】油佐剂ISA 61 VG佐剂和水佐剂GEL 02 PR制备的PCV2合成肽疫苗对预防PCV2感染具有较好的免疫保护作用,试验结果为PCV2合成肽疫苗的研究提供了数据基础。

【目的】了解河北地区动物源大肠杆菌分离菌株的耐药情况和各耐药菌株之间的亲缘关系,为有效防控大肠杆菌耐药性的产生提供科学依据。【方法】从河北省某养殖场采集健康动物的粪便样本297份(鸡源48份、猪源249份),通过细菌分离纯化和PCR扩增对分离菌株进行鉴定,采用药敏试验确定分离菌株的耐药表型,并对其进行耐药基因检测、血清型鉴定、系统发育群分析、质粒复制子分型和基因分型鉴定。【结果】分离菌株在麦康凯培养基上呈粉红色圆形菌落,经16S rDNA测序分析鉴定出129株大肠杆菌,其中92株大肠杆菌呈现多重耐药现象,主要以3~4耐为主,耐药基因以floR、tetA、qnrS和strB的检出率最高;多重耐药大肠杆菌以O132为优势血清型,系统进化群主要分布在A和B1群,主要流行质粒为IncFIB和IncN;经MLST分型获得27个ST型,主要为ST93型,其中12株序列型为未知型。【结论】河北地区健康动物肠道内大肠杆菌多重耐药现象较为严重,其血清型众多,分子特征呈现多样性,仍需加强对动物源大肠杆菌耐药性和分子特征的监测。

【目的】了解贵州省猪群伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)毒株与疫苗株的分子特征,探究贵州省PRV变异株的遗传演化情况并对比其与疫苗株抗原差异性。【方法】通过分子克隆和生物信息学技术对本实验室在2015－2021年间贵州省分离到的5株PRV毒株的gB、gC、gD基因和商品化疫苗株(C株和HB2000株)进行克隆测序,利用本实验室序列库中的2株PRV贵州株及GenBank上登录的疫苗毒株序列,进行系统遗传进化和B细胞线性抗原表位差异性分析。【结果】结果显示,7株贵州株与疫苗株gB、gC、gD全基因组的核苷酸序列相似性分别为98.1%~100%、94.7%~100%和98.8%~100%,7株贵州株与疫苗株gB、gC、gD全基因组的氨基酸序列相似性分别为96.4%~100%、90.9%~100%和97.0%~100%;氨基酸替换分析结果显示,7株PRV贵州株和疫苗毒株间gB、gC、gD基因存在56、68和23处氨基酸位点差异,其中gC基因氨基酸位点差异最大;GZQX2017株缺失gE基因,在遗传进化树中GZQX2017株与Bartha-K61、Becker和NIA3等国外株位于同一大进化分支,属于PRV Ⅰ型;其余6株贵州株gE基因在第48和496位各插入1个天冬氨酸(D),符合流行变异株的基因特征,与国内流行PRV变异株位于另一大进化分支,属于PRV Ⅱ型;以GZQX2017株gB、gC、gD全基因作为目标基因,以Bartha-K61株作为主要亲本、Fa株作为次要亲本,gB、gC全基因均能检测到重组信号,gD全基因重组信号不明显;相比Bartha-K61株,gB、gC、gD蛋白抗原表位数量和位点存在差异。【结论】7株PRV贵州株中,GZQX2017株与疫苗Bartha-K61株、C株属于PRV Ⅰ型,GZQX2017株可能是由Bartha-K61株为主要亲本进行重组产生的gE基因自然缺失株,后续有望将其作为候选疫苗株进行进一步研究;其余6株贵州株与Fa株、HB2000株等属于PRV Ⅱ型,具有流行变异毒株的流行特征。本研究结果对了解中国贵州省流行PRV毒株分子特征具有十分重要的意义。

【目的】克隆大片形吸虫丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(Ser/Thr protein phosphatases 2A,PP2A)基因并构建原核表达载体,获得原核表达蛋白,为探究PP2A基因功能及其在大片形吸虫的发育中的作用奠定基础。【方法】提取大片形吸虫成虫虫体组织总RNA,应用RT-PCR方法扩增PP2A基因的完整编码区序列,并以双酶切的方式连接pET-28a(＋)载体;经酶切、测序鉴定后获得阳性质粒pET-28a-PP2A,将pET-28a-PP2A重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化;通过SDS-PAGE及Western blotting检测大片形吸虫PP2A基因的表达效果;应用实时荧光定量PCR检测PP2A基因在大片形吸虫虫卵、囊蚴、6周龄童虫和成虫阶段中的表达情况。【结果】克隆的大片形吸虫PP2A基因编码区序列长1161 bp,编码386个氨基酸,分子式为C₁₉₈₀H₃₁₀₅N₅₃₅O₅₆₆S₂₄,分子质量为44.23 ku。生物信息学分析结果显示,大片形吸虫PP2A基因编码的蛋白为PP2Ac,分子功能为信号转导(GO:0004871),生物学过程为蛋白去磷酸化(GO:0006470),细胞组分为细胞质(GO:0005829)。PP2A蛋白无信号肽,不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白,共含有37个磷酸位点。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,大片形吸虫PP2A在30 ℃、0.8 mmol/L IPTG诱导6 h时表达量最大,表达产物主要以包涵体的形式存在,且Western blotting检测结果显示,重组蛋白可被抗His标签识别;实时荧光定量PCR结果显示,PP2A基因在大片形吸虫6周龄童虫阶段表达量最高,极显著高于其他阶段(P＜0.01);在囊蚴阶段的表达量最低,与虫卵阶段差异不显著(P＞0.05)。【结论】本研究成功构建了大片形吸虫PP2A原核表达载体并获得相应蛋白,为研究PP2A基因在大片形吸虫生长发育中的功能奠定了基础。

【目的】获得抗信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)蛋白的特异性纳米抗体,通过验证该纳米抗体在免疫组织化学和Western blotting检测中的应用及对黑色素瘤细胞B16生长的作用,对其功能进行鉴定。【方法】通过噬菌体展示淘筛技术从羊驼B16纳米抗体文库中筛选抗STAT3纳米抗体,获得阳性克隆并测序;根据序列信息设计和构建pColdⅠ原核表达质粒,并通过大肠杆菌进行纳米抗体表达;通过镍柱、分子筛和超滤管进行纯化和浓缩;利用免疫组织化学和Western blotting验证纳米抗体是否结合脑组织中STAT3蛋白;采用CCK8法分析该纳米抗体对B16细胞增殖的影响,并用Western blotting检测其对其分子路径相关基因表达的影响。【结果】经过噬菌体展示淘筛及阳性克隆测序后,成功获得1株特异性结合STAT3蛋白的纳米抗体单克隆菌株,命名为STAT3-VHH-10B;将构建的该纳米抗体的pColdⅠ原核表达载体进行诱导表达和纯化,SDS-PAGE结果显示,成功得到大小约为15 ku的抗STAT3纳米抗体;免疫组织化学和Western blotting结果显示,纯化制备的纳米抗体可成功检测到大脑组织中STAT3的表达;细胞增殖检测结果显示,该纳米抗体对B16细胞增殖具有明显的抑制作用,并下调细胞增殖路径的主要基因CycD1、Bcl2、cMyc编码蛋白的表达。【结论】本研究成功筛选到1株抗STAT3蛋白的特异性纳米抗体,且该纳米抗体可用于免疫组织化学和Western blotting法检测组织中STAT3的表达,此外,通过与抗原结合后,抑制主要基因CycD1、Bcl2、cMyc的表达,从而抑制B16细胞增殖。本研究结果将为STAT3及其纳米抗体的功能研究提供新工具。

肠道菌群是动物机体的重要组成部分,在漫长的进化过程中肠道菌群与机体达成了共存。很多寄生虫也寄生在宿主的肠道内,肠道菌群和寄生虫之间会相互影响,肠道菌群能影响寄生虫对宿主的侵入、定植、致病等复杂过程,还能调节动物机体的肠道健康,在颉颃细菌、病毒、肠道原虫等外来病原感染及维持肠道内环境稳态方面发挥着重要作用。肠道菌群可通过自身及其代谢产物影响宿主免疫能力,从而调节机体自身炎症反应,抵制肠道寄生虫感染。肠道菌群还能通过占位效应及自身菌群结构的变化对寄生虫入侵产生影响。现有研究发现,寄生虫感染对肠道菌群稳态的影响除机械性损伤、炎性反应等负面影响外,还能对宿主机体产生有益调节。部分虫体感染宿主后能激活机体相关免疫应答,刺激机体释放抗炎因子,进而帮助肠道抵抗细菌感染、减轻炎症反应。某些寄生虫排泄分泌物能在宿主体内影响肠道菌群结构,起到免疫调节剂的作用。近年来,菌群与宿主病原颉颃相关的互作机制已成为热点,备受国内外学者广泛关注。由此而引发的寄生虫疗法和肠道菌群移植技术也成为了研究热点。寄生虫与肠道菌群各自的代谢产物对于肠道内环境及稳态也有一定影响,但其作用的具体机制尚不清楚。国内有关寄生虫与肠道菌群互作机制的报道较少,笔者主要对寄生虫与肠道菌群的互作进行综述,以期为相关研究的开展提供参考。

【目的】了解鸭疫里默氏杆菌的耐药性、基因组结构与遗传变异程度,为鸭疫里默氏杆菌耐药性与基因组研究提供参考。【方法】本研究对1株从病死鸭脑组织分离的鸭疫里默氏杆菌疑似菌株进行了PCR鉴定、耐药性检测及全基因组框架图测序,并基于16S rDNA与管家基因对其进行了遗传进化分析。【结果】测序数据经过质控与过滤后成功组装为1个包含38个contigs的基因组框架,使用Abricate软件、CARD在线数据库共检测出6种不同的耐药基因,其中4种与耐药表型符合;将基因序列提交至MLST数据库,发现了一种新ST型,定为ST93。构建的16S rDNA和管家基因进化树结果表明,分离菌株与2株鸭疫里默氏杆菌具有较近的亲缘关系。【结论】分离鉴定得到1株鸭疫里默氏杆菌,该菌株为多药耐药菌株,其基因组中携带多个耐药基因;鸭疫里默氏杆菌的基因变异程度较大,且存在跨区域流行传播风险。在临床用药时应注意合理用药,及时监控抗性基因的水平转移,防止鸭疫里默氏杆菌跨区域流行。

【目的】查明并掌握辽宁地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行特性及生物学特点,为BVDV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】采集辽宁省某养牛场疑似发生BVDV感染的病死牛脾脏组织,用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)及BVDV基因特异性引物进行RT-PCR鉴定,将组织液接种MDBK细胞分离病毒。对细胞进行细胞病变效应(CPE)观察后再通过电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定病毒,PCR扩增病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】BVDV特异性引物RT-PCR鉴定结果为阳性,在280 bp处有条带,与预期条带大小相符,其余病原特异性引物未扩增出条带,证明未感染其他病原;分离得到的毒株在MDBK细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒纯化后,经电镜观察可见直径约为50 nm的病毒粒子;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的MDBK细胞内可观察到亮绿色荧光,而对照细胞没有荧光,将分离得到的病毒命名为LN-1株;全基因组扩增序列大小为12 269 bp,遗传进化分析发现,LN-1株与XC、SD-15及ZM-95株在同一分支,与XC株核苷酸相似性为96.2%,属于BVDV-1m型。【结论】本研究成功分离出1株1m型BVDV毒株,对后续疫苗研发、流行病学调查及致病机理等方面研究具有重要意义。

【目的】对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白7(nonstructural protein 7,NSP7)进行真核表达及生物信息学分析,从而推测其在PRRSV复制过程中的功能。【方法】按照GenBank数据库中NSP7基因序列合成目的基因并构建真核表达载体P3×FLAG-CMV-NSP7,瞬时转染Marc-145细胞后通过Western blotting验证蛋白表达,通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)对NSP7蛋白进行亚细胞定位,利用生物信息学分析软件预测NSP7蛋白的理化性质、结构及功能。【结果】成功构建P3×FLAG-CMV-NSP7真核表达载体;Western blotting结果显示,获得大小约为2.7 ku的目的条带,证实重组载体在Marc-145细胞中高效表达。IFA结果证实在PRRSV感染初期NSP7蛋白大部分分布于细胞质中,随着感染时间延长NSP7蛋白由细胞质进入细胞核。生物信息学分析结果显示,NSP7蛋白由259个氨基酸编码,分子式为C₁₂₈₄H₂₀₂₀N₃₄₈O₃₇₉S₈,分子质量为28652.75 u,理论等电点为5.88,为不稳定、亲水蛋白。结构预测发现,NSP7蛋白二级结构包括α-螺旋和β-转角,占比分别为35.91%和5.41%。核定位序列分析发现,NSP7蛋白具有一段跨膜序列RLNKKKRRRMEAVGIF。【结论】本研究成功构建高效表达的PRRSV NSP7真核表达载体,在PRRSV感染初期NSP7蛋白分布于细胞质,感染后期分布于细胞核,NSP7蛋白存在核定位序列。

【目的】筛选宽谱鸭疫里默氏菌噬菌体,作为治疗用噬菌体组合的候选毒株。【方法】以不同含量的噬菌体进行噬斑分析测定35株噬菌体的噬菌谱;利用透射电镜观察、热与酸碱稳定性评估、最佳感染复数(MOI)测定、一步生长试验、杀菌试验分析噬菌体的形态结构和部分生物学特性。【结果】35株噬菌体中vB_RanS_202的裂解谱最宽,能裂解42%(42/100)的鸭疫里默氏菌,包括血清1、2、6、10、11和13型共6种血清型菌株。该噬菌体由直径约60 nm的截面为六边形的头部和长约220 nm的尾部组成,不耐热,效价为1.0×10⁷ PFU/mL的噬菌体,经50 ℃水浴80 min或60 ℃水浴20 min,即降为1.8×10⁵~2.6×10⁵ PFU/mL。在pH 5.0~9.0的环境中能维持活性。以RAf488为宿主菌测得其最佳MOI为0.01。一步生长曲线显示,其潜伏期和暴发期分别为60和75 min,平均裂解量约为150 PFU/cell。在宿主菌RAf488中的杀菌试验结果显示,MOI在0.004~0.016时,vB_RanS_202均具有杀菌作用。【结论】噬菌体vB_RanS_202具有宽裂解谱的特点,具备在液体培养基中的杀菌能力。本研究结果为后续噬菌体治疗用毒株的筛选提供参考。

【目的】探究黄芪多糖对嗜水气单胞菌灭活疫苗在杂交鲟鱼上的应用效果,以期发掘黄芪多糖用作疫苗佐剂的应用潜力。【方法】选取健康杂交鲟鱼140尾,随机分为4组(对照组、疫苗组、黄芪多糖组和联用组)并做相应免疫处理,分别于第0、7、14、21和28天采集血液,进行抗氧化指标(超氧化物歧化酶(SOD))和免疫相关指标(溶菌酶(LYZ)、酸性磷酸酶(ACP)、免疫球蛋白M(IgM)及补体C3(C3))检测;免疫结束时进行攻毒试验,观察鲟鱼死亡情况及其免疫组织病理变化。【结果】第7、14、21和28天时,与对照组相比,联用组和疫苗组杂交鲟鱼血清SOD、LYZ、ACP活性及IgM、C3含量均显著或极显著升高(P＜0.05;P＜0.01),黄芪多糖组SOD、ACP活性及IgM、C3含量均显著或极显著升高(P＜0.05;P＜0.01),LYZ活性无显著差异(P＞0.05);与疫苗组相比,黄芪多糖组血清LYZ、ACP活性均显著降低(P＜0.05),SOD活性及IgM、C3含量均无显著差异(P＞0.05);与黄芪多糖组或疫苗组相比,联用组血清SOD、LYZ活性及ACP含量均显著增加(P＜0.05),IgM含量显著降低(P＜0.05),C3含量无显著差异(P＞0.05)。黄芪多糖与灭活疫苗联用能有效增强鲟鱼的抗病力,相对免疫保护率达100%,对鲟鱼肝脏、脾脏和肠道组织无明显病理损伤。【结论】黄芪多糖与杂交鲟用嗜水气单胞菌灭活疫苗联用时能有效提升疫苗的抗体效价,增强该灭活疫苗接种后的保护力,从而诱导杂交鲟鱼产生免疫应答,提高自身抗病力,为嗜水气单胞菌引起的鱼类疾病防控提供了理论参考。

【目的】建立一种猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的IgA抗体ELISA检测方法。【方法】以PEDV流行株CH/HNPJ/2017(MF152604.1)为生物材料,通过RT-PCR扩增出S2基因(2368—4170 bp),并将其插入到原核表达载体pET-24a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,经镍柱纯化。Western blotting验证重组蛋白S2与PEDV阳性血清的反应原性和特异性。将其作为包被抗原,建立一种基于PEDV变异毒株重组全长S2蛋白的IgA抗体ELISA方法,用棋盘法确定该方法的最优检测条件,对其敏感性、特异性和重复性进行测定,并初步应用于130份猪血清和40份猪口腔黏液的检测。【结果】通过RT-PCR方法扩增出S2基因,成功构建重组表达载体pET-24a-S2,转化大肠杆菌经诱导表达纯化后获得重组S2蛋白。SDS-PAGE结果显示,纯化的S2蛋白条带特异且无杂带;Western blotting试验表明该蛋白与PEDV阳性猪血清具有良好的反应性。ELISA方法反应条件优化结果显示,重组S2蛋白的最佳包被条件为每孔0.5 μg、4 ℃过夜包被;血清最佳反应条件为1∶160稀释,37 ℃孵育60 min;酶标二抗最佳反应条件为1∶5000稀释,37 ℃反应30 min;TMB最佳显色时间为室温下10 min。待检样品S/P值≥0.04时为阳性,S/P值≤0.02时为阴性,S/P值介于0.02~0.04之间为可疑。利用本试验建立的ELISA方法检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪德尔塔冠状病毒标准阳性血清,S/P值均<0.02,显示为阴性,说明该方法具有良好的特异性;将PEDV阳性血清进行640倍稀释时利用该方法检测仍为阳性,说明该方法具有良好的敏感性;利用该方法进行批间批内试验,变异系数均小于8%(在10%以内),表明该方法具有良好的重复性。利用该方法检测保存的130份猪血清,结果与IDEXX IgA抗体检测试剂盒的符合率为90.77%;该方法对40份猪口腔黏液的检测结果表明,阳性检出率为90.0%,阴性检出率为为93.3%。【结论】本研究成功构建pET-24a-S2重组质粒,获得纯度较高的重组S2蛋白,并以此作为包被蛋白建立了基于全长S2蛋白IgA抗体ELISA检测方法。该方法能同时有效检测血清和口腔黏液样本,且敏感性强、特异性高、稳定、重复性好,该方法对PEDV的临床诊断及防控具有重要临床实践意义。

【目的】分析确定黄柏、石菖蒲合剂抗炎作用的药效物质基础,并确定可能的作用靶点。【方法】通过小鼠耳廓肿胀试验检测黄柏、石菖蒲合剂的抗炎作用,通过网络药理学方法分析其与炎症相关蛋白的互作网络图,采用Cytoscape 3.6.1软件绘制药物-活性成分-疾病-共同靶点网络图,并进行GO功能和KEGG通路富集分析,应用AutoDock软件将主要活性成分与核心靶点进行分子对接。【结果】黄柏、石菖蒲合剂对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的抑制率为56.96%,与模型组差异显著(P＜0.05)。通过网络药理学分析共获得30个黄柏、石菖蒲合剂性化合物,包括槲皮素、小檗碱、山柰酚等;获得25个黄柏、石菖蒲合剂与炎症交集靶点,包括白细胞介素-6(IL6)、IL1β、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)等;GO功能富集结果显示,生物过程、细胞组分和分子功能分别获得334、13和27个条目,其中生物过程涉及正调控一氧化氮生物合成过程、正调控凋亡过程、正调控平滑肌细胞增殖、炎症反应等;细胞组分涉及细胞外间隙、胞外区、分泌颗粒等;分子功能涉及细胞因子活性、酶结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、配体激活序列特异性DNA结合等方面。KEGG结果分析得到82条通路,发现黄柏、石菖蒲合剂抗炎与TNF信号通路、IL17信号通路、脂质和动脉粥样硬化等可能有一定关系。【结论】黄柏、石菖蒲合剂具有较好的抗炎效果,其抗炎机制可能涉及多种活性成分对不同信号通路基因和蛋白表达的调节,说明黄柏、石菖蒲合剂是通过多成分、多通路、多靶点发挥抗炎作用。

【目的】研究刺五加水提物(Acanthopanax senticosus aqueous extract,ASAE)对鳜蛙虹彩病毒(Mandarin ranavirus,MRV)的抑制作用及其对大口黑鲈免疫调节功能的影响。【方法】用不同剂量ASAE(1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL)与MRV同时作用鳜鱼脑细胞系(SCB3),检测ASAE对MRV的抑制活性。在基础饲粮中添加5‰ ASAE,连续饲喂大口黑鲈15 d,实时荧光定量PCR和流式细胞术分析ASAE对大口黑鲈免疫功能的影响,并以1×10⁷ TCID₅₀/mL MRV腹腔注射攻毒,分析ASAE抗MRV保护效果。【结果】1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL ASAE对MRV抑制率分别为95.27%、91.36%、84.55%、60.05%、32.16%和2.49%。实时荧光定量PCR结果显示,ASAE诱导大口黑鲈白介素-10(interleukin-10,IL-10)、酪氨酸激酶(tyrosine-protein kinase,Lyn)、肌动蛋白相关蛋白(actin related protein 2/3 complex,subunit 5,ARPC5)、Fcγ受体Ⅰa(Fcγ receptor Ⅰa,FcγRⅠa)等Fcγ受体吞噬通路相关基因显著性上调表达(P＜0.05);流式细胞术分析结果显示,添加ASAE明显提高了大口黑鲈头肾白细胞吞噬能力(吞噬率80.9%)。攻毒试验结果显示,ASAE对MRV的相对保护率为30.48%。与对照组相比,ASAE明显延缓了大口黑鲈死亡时间,且添加ASAE组脑、脾脏、中肠、后肠组织的病毒拷贝数显著降低(P＜0.05)。【结论】ASAE可显著激活大口黑鲈吞噬活性,发挥免疫调节作用,体内外试验均表明ASAE具有优异的抗MRV效果,可以有效预防MRV感染。

【目的】试验旨在建立以鸡白痢沙门氏菌的毒力相关基因所编码的IPAJ蛋白为抗原的间接ELISA方法。【方法】PCR扩增IPAJ基因并连接到pCzn1表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPAJ基因重组蛋白用IPTG进行诱导表达并纯化,通过Western blotting验证蛋白的反应原性。用纯化的IPAJ蛋白免疫60日龄试验兔,共免疫3次,制备其多克隆抗体,通过ELISA方法检测抗体效价。采用方阵滴定法优化以IPAJ蛋白作为诊断抗原的ELISA条件,初步建立以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,并与平板凝集试验结果进行比较。【结果】试验成功构建鸡白痢沙门氏菌IPAJ原核表达载体,并以包涵体形式纯化出重组蛋白,具有良好的反应原性。Western blotting分析结果显示,成功表达出32 ku的IPAJ蛋白,具有良好的特异性。间接ELISA检测结果显示,多克隆抗体效价为1∶25600,表明成功制备出多克隆抗体。建立的以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法的最佳优化条件为:抗原包被浓度为5 μg/mL,5%脱脂奶粉封闭1.5 h,一抗最佳稀释浓度为1∶250(孵育1 h),二抗最佳稀释浓度为1∶10000(孵育1 h),避光显色15 min。与平板凝集试验结果的符合率为91.00%。【结论】鸡白痢沙门氏菌IPAJ重组蛋白具备良好的特异性及反应原性,初步建立的鸡白痢沙门氏菌间接ELISA诊断法具有一定的实用性,可应用于临床大批量检测,为后续建立快捷的诊断方法提供依据。

【目的】利用网络药理学及分子对接技术分析赤芍抗氧化应激作用的有效活性成分及其分子机制。【方法】运用TCMSP数据库搜集赤芍的活性成分和靶点,借助UniProt数据库对靶点进行基因名转化;通过GeneCards和OMIM数据库检索氧化应激的相关基因,利用Veeny在线平台获得赤芍与氧化应激的交集靶点,将交集靶点上传至STRING数据库和Cytoscape 3.8.0软件建立蛋白互作(PPI)网络图和赤芍-靶点-氧化应激可视化网络并进行拓扑学分析,筛选关键靶点;运用Metascape数据库对关键靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,确定赤芍发挥抗氧化应激作用的活性成分和信号通路;运用AutoDock和PyMol软件对赤芍发挥抗氧化应激作用的核心靶点进行分子对接验证。【结果】共筛选到12个赤芍活性成分,包括黄芩素、β-谷甾醇、鞣花酸、豆甾醇、(+)-儿茶素等;赤芍活性成分与氧化应激靶点分别有76和4 873个,其中赤芍与氧化应激交集靶点共69个,包括蛋白激酶B(AKT1)、转录因子AP-1(JUN)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、肿瘤坏死因子(TNF)和半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)等;GO功能和KEGG通路富集结果提示,赤芍抗氧化应激与磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、核因子κB(NF-κB)等多个信号通路有关;分子对接结果表明,赤芍主要活性成分黄芩素、β-谷甾醇与核心靶点有较好的结合能力。【结论】赤芍可能通过黄芩素、β-谷甾醇、鞣花酸等活性成分调控PI3K-Akt、NF-κB、白细胞介素-17(IL17)等信号通路中的关键靶点来发挥抗氧化应激作用。

【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV) p30蛋白的单克隆抗体,为非洲猪瘟快速诊断检测方法的建立和疫苗研究提供材料。【方法】构建p30原核表达质粒pET-30a(+)-p30,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,通过镍柱亲和层析获得目的蛋白。p30复性后,每2周对BALB/c小鼠免疫3次,将免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,通过ELISA方法和亚克隆筛选分泌抗体的杂交瘤细胞。将筛选出的单克隆细胞注射进小鼠腹腔制备腹水,通过Western blotting检测、免疫荧光测定(IFA)和抗体亚型分析来鉴定单克隆抗体。【结果】试验成功构建了p30蛋白的原核表达质粒,并使用IPTG诱导、纯化获得了原核系统表达的重组p30蛋白;成功制备出4株能稳定分泌针对ASFV p30蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为:1H3B4、3F2F5、6E3A1和9D6B9。经ELISA测定抗体腹水效价在1∶100000~1∶1000000之间。经Western blotting和IFA鉴定筛选得到的单克隆抗体与p30蛋白能发生特异性反应。经亚型鉴定,3F2F5和9D6B9 2株单克隆抗体的重链均为IgG2b,轻链均为Kappa;6E3A1株单克隆抗体的重链为IgM,轻链为Kappa;1H3B4株单克隆抗体的重链为IgG2b,轻链为Lambda。【结论】试验成功制备了4株针对ASFV p30蛋白的单克隆抗体,并分析了单克隆抗体的免疫学特性,为p30蛋白的生物学功能研究和ASFV血清学检测提供依据。

【目的】了解湖北地区鸭疫里氏杆菌病的分布流行与耐药情况,为该地区肉鸭养殖场鸭疫里氏杆菌病的临床用药提供参考。【方法】对武汉周边区县(江夏区、黄陂区、黄梅县)肉鸭养殖场的鸭疫里氏杆菌疑似病例进行采样并分离病原菌,对分离菌的形态学、染色特性、生化特性、16S rRNA进行鉴定,并对鉴定为鸭疫里氏杆菌的分离株进行血清型和耐药性分析。利用标志基因整合酶的特异性引物PCR鉴定分离菌基因组,判断是否整合有50K基因岛。【结果】分离鉴定了3株鸭疫里氏杆菌,3株分离菌均能在TSA平皿培养基中生长为光滑的半透明状菌落,革兰氏染色为阴性、瑞氏染色可观察到两极浓染;生化试验结果显示,3株鸭疫里氏杆菌均不发酵多种糖类,过氧化氢酶阳性,不产硫化氢,不能液化明胶。16S rRNA鉴定结果显示,获得大小为1480 bp的目的条带,血清型均为1型;50K基因岛标志基因PCR扩增结果显示,仅黄梅分离株(HM株)含有该基因岛。最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)试验与纸片扩散(Kirby-Bauer,K-B)试验测定耐药性结果显示,3株分离菌株均对青霉素、阿莫西林、头孢曲松、头孢噻肟、氟苯尼考及庆大霉素敏感,对萘啶酮酸、壮观霉素、恩诺沙星、多黏菌素B表现出不同程度的耐药性。【结论】分离鉴定了3株血清1型鸭疫里氏杆菌,药敏试验结果对本地区鸭疫里氏杆菌病的防治及流行病学研究提供一定的理论指导。

【目的】了解和掌握嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria,As)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,Av)混合感染大口黑鲈的致病性并筛选出防治气单胞菌感染的有效中药,为气单胞菌混合感染的防治提供理论依据。【方法】将Ah、As和Av通过腹腔注射健康大口黑鲈,构建3种气单胞菌单独感染和混合感染大口黑鲈的动物模型,通过脏器系数、组织病理切片和死亡率等分析气单胞菌混合感染的致病性;通过体外抑菌试验从37味中药中筛选对气单胞菌具有抑制效果的敏感中药,利用网络药理学解析乌梅-全蝎双药方在体内发挥抗菌作用的关键活性成分和作用靶点,并通过药浴试验分析其对气单胞菌混合感染大口黑鲈的治疗效果。【结果】3种气单胞菌混合感染对大口黑鲈的致病性高于单独感染,Ah能造成最严重的脏器损伤、炎症和最高的死亡率,As次之,Av最弱。中药乌梅和全蝎对Ah、As和Av在体外均具有显著抑制效果,二者联用时抑菌效果增强。网络药理学分析发现,乌梅-全蝎双药方的活性成分和细菌感染的交集作用靶点共180个,其中肿瘤蛋白53(tumor protein 53,TP53)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT serine/threonine kinase 1,AKT1)等11个靶点是乌梅-全蝎双药方治疗细菌感染潜在的关键靶点;乌梅-全蝎双药方能显著减轻气单胞菌混合感染产生的临床症状、肝脏与肠道的炎症及细胞的坏死,使气单胞菌混合感染的大口黑鲈的死亡率下降了66.7%,具有良好的治疗效果。【结论】Ah、As和Av混合感染大口黑鲈较单独感染具有更强的致病性,乌梅-全蝎双药方能显著提高气单胞菌混合感染大口黑鲈的成活率。本试验结果可为气单胞菌混合感染的致病机制及精准防控研究提供理论依据。

【目的】对杭州野生动物世界1例成年雌性华南虎(Panthera tigris amoyensis)子宫内膜炎病例的病原进行分离鉴定及生物学特性研究。【方法】无菌采集患虎子宫分泌物进行细菌分离培养、形态观察、梅里埃Vitek^® 2 COMPACT系统的生化鉴定以及16S rDNA序列分析,采用小鼠腹腔接种模型检测临床分离株致病性,并通过药敏纸片扩散法K-B鉴定该菌对50种药物的敏感性,采用筛选的敏感药物联合对症治疗,持续观察疾病是否复发及其产仔情况。【结果】从患虎子宫分泌物中获得1株革兰阴性短棒状杆菌;梅里埃Vitek^® 2 COMPACT系统革兰阴性卡鉴定结果显示,该临床分离株为摩氏摩根菌,菌株可发酵葡萄糖,分解甘露糖、D-葡萄糖,且尿素酶、磷酸酶、鸟氨酸脱羧酶、γ-谷氨酰转移酶反应呈阳性;序列比对分析发现,16S rDNA序列与摩氏摩根菌的相似性最高,达99%以上,进一步表明该菌为摩氏摩根菌,并命名为HNH2019;药敏结果显示,该菌多重耐药,对多黏菌素B、丁胺卡那、复方新诺明、麦迪霉素、四环素、头孢哌酮等33种药物呈不同程度的耐药,对头孢噻肟、头孢曲松和头孢西丁等6种药物中度敏感,对妥布霉素、洛美沙星、依诺沙星和氟苯尼考等11种药物敏感;小鼠致病性分析结果显示,该分离株腹腔接种ICR小鼠的半数致死量为1×10^7.5 CFU;采用敏感药物治疗后,该虎痊愈且连续3年未复发,截至2022年9月,该母虎已经多次怀孕并合计生产了5仔。【结论】本研究分离鉴定到1株华南虎源多重耐药致病性摩氏摩根菌,经筛选的敏感药物治疗,该虎子宫内膜炎痊愈未复发,研究结果为同类疫病防治提供了病例参考和数据支持,提示应重视摩氏摩根菌对动物的潜在危害。

【目的】探讨黄芩对安普霉素耐药大肠杆菌的耐药消除作用。【方法】制备黄芩醇提物,采用琼脂稀释法检测黄芩醇提物对耐药大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC),通过耐药消除试验和影印法检测耐药消除率。进而采用微量肉汤稀释法和纸片扩散法检测消除前后大肠杆菌耐药性的变化,扫描电镜法观察细菌形态的变化,实时荧光定量PCR法检测耐药相关基因相对表达量的变化。【结果】黄芩醇提物对安普霉素耐药大肠杆菌的MIC为41.25 mg/mL,对耐药大肠杆菌的耐药消除率为11.7%~17.0%。黄芩醇提物处理后,大肠杆菌的MIC值由256 μg/mL降至16~32 μg/mL;扫描电镜观察发现,黄芩醇提物处理组细菌表面受损,菌体形态异常;实时荧光定量PCR检测结果显示,黄芩醇提物极显著提高了大肠杆菌中ompF、fimA、phnE和fhuF基因mRNA的相对表达量(P＜0.01)。【结论】黄芩醇提物能提高ompF、fimA、phnE和fhuF基因的表达水平,破坏细菌表面,提高大肠杆菌敏感性,发挥对安普霉素耐药大肠杆菌的耐药消除作用。