【目的】克隆牛介体复合物亚单位28(mediator complex subunit 28,MED28)基因CDS区,预测MED28蛋白的结构功能,并分析MED28基因在牛各组织中的表达水平,为后续研究MED28基因的功能奠定基础。【方法】以牛成肌细胞RNA反转录的cDNA为模板,利用PCR方法扩增并克隆牛MED28基因CDS区。运用MegAlign、Mega 11.0软件进行MED28蛋白的相似性比对和系统进化树构建,利用ProtParam、ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL、MEME、STRING等在线软件分析MED28蛋白的理化性质及结构功能,并通过实时荧光定量PCR检测MED28基因在牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、肌肉组织中的表达量。【结果】试验成功克隆MED28基因CDS区,长度为537 bp,编码178个氨基酸。相似性比对结果表明,牛MED28蛋白与山羊、绵羊的相似性最高;系统进化树显示,牛与山羊、绵羊的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。MED28蛋白属于不稳定的亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,主要在细胞外发挥作用,含有2个N-糖基化位点和21个磷酸化位点。MED28蛋白二级结构由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,其中α-螺旋占比最大,蛋白结构稳定,与三级结构预测结果一致。蛋白互作网络分析表明,MED28蛋白与其家族的多种蛋白之间存在互作,且主要在转录途径和甲状腺信号通路中发挥作用。MEME预测结果表明,MED28蛋白的保守基序在牛、人、猪、小鼠、马、兔、山羊、绵羊之间是相同的;MED28蛋白结构域有低复杂度和卷曲螺旋序列。实时荧光定量PCR结果表明,MED28基因在牛肌肉组织中的表达量显著高于其他组织(P＜0.05)。【结论】牛和羊的亲缘关系最近、蛋白相似性高。MED28蛋白亲水且结构稳定,存在N-糖基化位点和磷酸化位点,无跨膜区和信号肽,主要分布在细胞外,并参与转录途径和甲状腺信号通路。MED28基因在牛肌肉组织中高表达。以上结果可为进一步研究牛MED28基因的功能提供参考。

【目的】本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。【方法】分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3'-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10⁶、5.62×10³、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。【结果】本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62 拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。【结论】本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。

【目的】评价不同浓度番茄红素(lycopene,LCP)对顺铂(CDDP)诱导大鼠脏器损伤的保护效果。【方法】将30只雄性Wistar大鼠随机分为5组(n＝6),分别为对照组(CON)、CDDP组及不同浓度LCP处理组(5 mg/kg,LLCP组;10 mg/kg,MLCP组;50 mg/kg,HLCP组)。CON和CDDP组大鼠每天灌胃1 mL/kg玉米油,LLCP、MLCP和HLCP组大鼠每天灌胃相应浓度的LCP,连续灌胃28 d。除CON组外,其余各组在第26天单次腹腔注射CDDP(7 mg/kg)。试验结束后采集大鼠胃、小肠(十二指肠、空肠和回肠)、肝脏、肾脏组织及血液样本。通过生理和生化指标检测、HE染色、ELISA和Western blotting方法评价不同浓度LCP在CDDP所致大鼠急性损伤中的保护作用。【结果】与CON组相比,CDDP组大鼠体重、采食量和饮水量均极显著或显著下降(P＜0.01;P＜0.05),血清中谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)等6项生化指标水平、丙二醛(MDA)、白细胞介素-8(IL-8)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量均显著或极显著升高(P＜0.05;P＜0.01),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性极显著下降(P＜0.01),大鼠胃、小肠、肝脏和肾脏组织病理学损伤严重。与CDDP组相比,MLCP组大鼠体重、采食量和饮水量均显著升高(P＜0.05),血清中AST、ALT等6项生化指标水平以及MDA、IL-8、TNF-α和IL-6含量均显著降低(P＜0.05),脏器组织病理学损伤减轻。Western blotting结果显示,与CON组相比,CDDP组大鼠不同组织中TNF-α和IL-6蛋白表达量均极显著升高(P＜0.01),IL-10蛋白表达量极显著下降(P＜0.01)。与CDDP组相比,MLCP组大鼠各组织中TNF-α和IL-6蛋白表达量均极显著或显著降低(P＜0.01;P＜0.05),IL-10蛋白表达量均显著或极显著升高(P＜0.01;P＜0.05)。【结论】LCP能通过抑制氧化应激和炎症反应改善CDDP诱导的大鼠胃、小肠、肝脏和肾脏损伤,本试验条件下10 mg/kg LCP作用效果最佳。

【目的】探究甜茶树苷H抑制NLRP3/ASC/Caspase1通路从而改善高糖导致的小鼠肾足细胞(MPC-5)的损伤作用。【方法】试验采用不同浓度(0、3.25、7.5、15、30、60、120 μmol/L)甜茶树苷H分别孵育MPC-5细胞,通过CCK-8法检测细胞活力,判定安全给药浓度。将MPC-5细胞分为空白对照组(CON)、D(+)-无水葡萄糖等渗对照组(MA)、高糖组(HG)以及不同浓度(3.25、7.5、15 μmol/L)甜茶树苷H组(CY3.25、CY7.5和CY15组)。HG和不同浓度甜茶树苷H组分别加入30 μmol/L D(+)-无水葡萄糖,MA组加入5.5 mmol/L D(+)-无水葡萄糖＋24.5 mmol/L甘露醇,CON组加入不含FBS的DMEM培养基,孵育细胞24 h后,CY3.25、CY7.5和CY15组培养基更换为不同浓度甜茶树苷H,并再次孵育细胞24 h。收集细胞,采用CCK-8法和乳酸脱氢酶(lactate hydrogenase,LDH)法分别检测细胞活力和损伤程度;利用碘化丙啶(PI)荧光染色法检测细胞凋亡率;通过免疫荧光法观察MPC-5细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)共定位情况;采用ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素-1β前体(Pro-IL-1β)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量;通过Western blotting检测NLRP3、ASC、半胱氨酸天冬酶1(Caspase1)/半胱氨酸天冬酶1前体(Pro-Caspase1)以及肾结蛋白(Desmin)、肾病蛋白(Nephrin)、线粒体裂变因子(MFF)、胶原Ⅳ(Collagen Ⅳ)蛋白表达量。【结果】与0 μmol/L甜茶树苷H组相比,7.5和15 μmol/L甜茶树苷H组细胞活力显著升高(P＜0.05),30、60和120 μmol/L甜茶树苷H组细胞活力显著降低(P＜0.05)。因此,后续选择3.25~15 μmol/L为甜茶树苷H的安全作用浓度。采用以上安全作用浓度甜茶树苷H处理细胞,结果显示,与HG组相比,CY3.25、CY7.5和CY15组细胞活力显著升高(P＜0.05),细胞上清液中LDH活力显著降低(P＜0.05),且呈现剂量依赖性;CY7.5和CY15组细胞凋亡率显著降低(P＜0.05)。免疫荧光法检测结果显示,与CON组相比,HG组细胞中NLRP3、ASC荧光增强且出现红绿荧光标记重叠现象;与HG组相比,CY3.25、CY7.5组细胞中NLRP3、ASC荧光减弱,未观察到红绿荧光标记重叠现象,CY15组细胞中NLRP3、ASC无荧光阳性标记。ELISA检测结果显示,与HG组相比,CY15组细胞中IL-1β和Pro-IL-1β释放量比值显著降低(P＜0.05)。Western blotting 检测结果显示,与HG组相比,CY15组细胞中NLRP3、ASC、Desmin、MFF、Collagen Ⅳ及Caspase1/Pro-Caspase1表达量均显著降低(P＜0.05),Nephrin蛋白表达量显著升高(P＜0.05)。【结论】甜茶树苷H能改善高糖诱导导致的MPC-5细胞损伤,其主要通过改变NLRP3/ASC/Caspase1通路中相关蛋白的表达,从而发挥对细胞的保护作用。

【目的】研究诃子提取物(chebuli extract,CE)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激肉鸡肠道形态、肠道和肝脏炎症反应的影响,以期为功能性饲料添加剂的开发提供理论依据。【方法】采用双因素试验设计,选取40只健康的1日龄罗斯308肉鸡,随机分为2组:对照组和CE处理组,每组5个重复,每个重复4只鸡。对照组肉鸡饲喂基础饲粮,CE处理组肉鸡在基础饲粮基础上添加1 000 mg/kg诃子提取物。试验期29 d。第29天,从每个重复中取2只肉鸡腹腔注射1 mg/kg BW LPS,另2只肉鸡腹腔注射等体积生理盐水。注射LPS 3 h后屠宰肉鸡,采集肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊并称重,计算脏器系数,并检测肠道组织形态、肠道屏障功能相关基因、肠道和肝脏炎症反应相关基因的表达水平。【结果】①与未经LPS刺激肉鸡相比,LPS刺激显著降低了肉鸡十二指肠的绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度和绒毛面积,以及空肠绒毛高度、回肠绒毛面积(P＜0.05);添加诃子提取物显著降低了肉鸡空肠的隐窝深度,显著升高了空肠和回肠的绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度、绒毛面积(P＜0.05)。在LPS刺激下,添加诃子提取物显著升高了肉鸡十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度,以及十二指肠和回肠的绒毛高度/隐窝深度、空肠和回肠的绒毛面积(P＜0.05)。②与未经LPS刺激肉鸡相比,添加诃子提取物显著提高了肉鸡黏蛋白2(Mucin-2)、闭锁小带蛋白1(zonula occluden-1,ZO-1)、闭锁蛋白(Occludin)基因表达量(P＜0.05)。在LPS刺激下,添加诃子提取物显著上调了肉鸡Claudin-1、Mucin-2、ZO-1基因表达量(P＜0.05)。③与未经LPS刺激肉鸡相比,LPS刺激显著提高了肉鸡肝脏基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-8和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因表达量(P＜0.05);添加诃子提取物显著下调了肉鸡肝脏MMP9、IL-1β和IL-8基因表达量(P＜0.05)。在LPS刺激下,添加诃子提取物显著下调了肉鸡肝脏MMP9和γ-干扰素 (interferon-γ,IFN-γ)基因表达量(P＜0.05)。【结论】诃子提取物改善了LPS刺激肉鸡肠道形态结构,提高了肠道屏障功能,且具有缓解LPS刺激肉鸡肝脏炎症反应作用。研究结果为将诃子提取物作为天然饲料添加剂的应用提供了理论依据。

【目的】探究饲粮中添加不同浓度香芹酚对育成期水貂生长性能、血清生化指标及肠道菌群的影响,从而筛选出对水貂各方面有益的香芹酚最适浓度。【方法】选取40只短毛黑公貂,随机分为4组,每组10只,每只为1个重复,对照组水貂饲喂基础饲粮,A、B、C组水貂分别在基础饲粮基础上添加100、200 和300 mg/kg香芹酚。预试期7 d,正试期42 d。饲养期结束后进行生长性能、血清生化指标和肠道菌群检测。【结果】饲粮中添加香芹酚对水貂生长性能(除终末体重外)无显著影响(P＞0.05);300 mg/kg香芹酚可显著提高水貂过氧化氢酶(CAT)活性及隐窝深度(P＜0.05);100 mg/kg香芹酚可显著提高水貂免疫球蛋白A(IgA)含量(P＜0.05);200和300 mg/kg香芹酚可极显著降低水貂丙二醛(MDA)含量(P＜0.01),显著提高水貂空肠绒毛高度(P＜0.05)。高通量测序结果显示,丰度＞1%的菌群共检测出以厚壁菌门(Firmicutes)为主的9类菌门,以及以乳球菌属(Lactococcus)、链球菌(Streptococcus)等为主的43个菌属。【结论】在水貂饲粮中添加量为300 mg/kg香芹酚可改善空肠肠道发育及肠道菌群结构,提升水貂的健康状况。

【目的】研究热应激对山羊粪便菌群结构及代谢产物的影响。【方法】选择6只12月龄、体重(28.4±3.2)kg的大足黑山羊成年阉公羊,采用单因子自身对照试验设计,先后接受重度热应激(H组,温湿度指数(THI)=91)、中度热应激(M组,THI=84)和无热应激(L组,THI=71)3个阶段的处理,各阶段处理15 d,过渡期7 d。于各阶段的最后1 d 14:00采集直肠粪便用于微生物16S rRNA测序分析和代谢组学分析。【结果】3个处理组山羊粪便菌群多样性无显著差异(P＞0.05)。与L组相比,H和M组山羊粪便拟杆菌门相对丰度显著降低(P＜0.05),变形菌门相对丰度显著升高(P＜0.05);克里斯滕森菌科R-7属、狭窄梭状芽孢杆菌1属、梭菌家族XⅢ AD3011属等相对丰度显著升高(P＜0.05),拟杆菌属、未编码_f_毛螺菌属等相对丰度显著降低(P＜0.05);粪便中的莠去津、胆酸、牛磺胆酸盐、油酸、贯叶金丝桃素、牛磺胆酸等物质的含量显著增加(P＜0.05),脯氨酸-丙氨酸、精氨酸-苏氨酸、高藜芦酸等物质的含量显著降低(P＜0.05);热应激条件下粪便中的差异代谢物显著富集在牛磺酸和亚牛磺酸代谢、ABC转运蛋白、谷胱甘肽代谢及紧密连接等通路(P＜0.05)。【结论】热应激导致山羊粪便菌群结构改变,不利于山羊肠道健康;还使精氨酸和初级胆汁酸的生物合成代谢通路上调,有助于山羊适应高湿热环境;导致山羊代谢物中有毒物质含量提高,可能对肠道屏障和神经系统造成损伤。

【目的】探究"2＋2"生产模式下(1对种鸽1个繁殖周期哺育2只乳鸽)不同蛋白质水平对哺育期塔里木鸽种鸽生产性能、消化代谢及血浆生化指标的影响。【方法】选取繁殖性能相近的12~18月龄健康哺育期塔里木鸽种鸽60对,随机分为5组,每组12对,每对种鸽哺育2只乳鸽。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组种鸽分别饲喂蛋白质水平为12%、13%、14%、15%、16%的饲粮。预试期3 d,正试期28 d。哺育期结束后,测定种鸽的生产性能和消化代谢,并检测血浆生化指标。【结果】①饲粮蛋白质水平对哺育期种鸽平均日采食量有显著影响,其中试验Ⅱ组种鸽平均日采食量显著高于试验Ⅳ和Ⅴ组(P＜0.05),种鸽哺育期体重损失逐渐增加。②随着蛋白质水平的增加,种鸽的粗蛋白质表观消化率逐渐增加。饲粮不同蛋白质水平对种鸽哺育期粗蛋白质表观消化率有显著影响,其中试验Ⅰ组种鸽粗蛋白质表观消化率显著低于试验Ⅳ和Ⅴ组(P＜0.05)。③饲粮蛋白质水平对哺育期种鸽血浆中的高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平均有显著影响,其中试验Ⅲ组种鸽血浆中HDL水平显著低于其他各组,LDL水平显著高于其他各组(P＜0.05)。【结论】在本试验条件下,"2＋2"生产模式下哺育期塔里木鸽种鸽饲粮蛋白质适宜水平为13%。

【目的】研究饲粮中添加胍基乙酸对育肥猪生长性能、血清生化指标、抗氧化能力和免疫功能的影响,为胍基乙酸在生猪养殖业中的应用提供参考。【方法】选取36头体重相近且健康的杜×长×大三元杂交母猪,随机分为3组,每组6个重复,每个重复2头。对照组猪饲喂基础饲粮;试验组猪分别在基础饲粮中添加0.1%胍基乙酸(GAA组)和0.1%胍基乙酸+0.04%甜菜碱(GAA+BT组),试验期50 d。试验结束时,以重复为单位称育肥猪空腹重,计算育肥猪的生长性能;每个重复挑选1头猪进行前腔静脉采血,测定血清生化指标、抗氧化能力和免疫功能。【结果】①饲粮中添加胍基乙酸对育肥猪的生长性能无显著影响(P＞0.05)。②与对照组相比,GAA和GAA+BT组育肥猪血清中总蛋白、球蛋白、白细胞介素-2、白细胞介素-10、γ-干扰素和免疫球蛋白A含量均显著升高,GAA组育肥猪血清中免疫球蛋白G含量显著升高(P＜0.05);GAA和GAA+BT组育肥猪血清中肌酐、尿酸和乳酸脱氢酶水平均显著降低,GAA+BT组育肥猪血清中丙二醛含量显著降低(P＜0.05)。③与对照组和GAA组相比,GAA+BT组育肥猪血清中总抗氧化能力显著升高(P＜0.05)。④与对照组和GAA+BT组相比,GAA组育肥猪血清中肿瘤坏死因子-α含量显著升高(P＜0.05)。【结论】饲粮中添加胍基乙酸不影响育肥猪的生长性能,但可改善育肥猪机体代谢水平,增强抗氧化能力和免疫功能,且单独使用和联合添加甜菜碱均具有效果。

【目的】甲酸钙作为小分子质量的有机钙源,在改善蛋鸡生产方面具有很好的应用潜力。本研究旨在揭示饲粮添加甲酸钙对老龄蛋鸡生产性能、血液指标和鸡蛋品质的影响及适宜添加水平。【方法】试验采用单因子试验设计,选取360只62周龄健康海兰褐蛋鸡,随机分入4个处理组,每处理6个重复,每重复15只鸡。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别饲喂以0.5%、1.0%和2.0%甲酸钙部分替代石粉的基础饲粮,各组饲粮的钙水平相同。正式期12周,每天记录产蛋情况,每周结料。在试验第2、4、6和8周测定鸡蛋品质相关指标;试验结束时,每重复取1只蛋鸡,采集血样,测定血常规和血清生化指标,然后屠宰测定脏器系数和胫骨质量。【结果】与对照组相比,饲粮添加甲酸钙对蛋鸡生产性能、第2和4周蛋品质无影响(P＞0.05),但增加了第8和12周的蛋壳比、蛋壳厚度和蛋壳强度(P＜0.05),其中0.5%添加水平效果最佳;降低了蛋鸡血液中中性粒细胞含量(P＜0.05),增加了血红蛋白含量、红细胞压积及单核白细胞、嗜碱性粒细胞含量(P＜0.05);降低了蛋鸡血清总蛋白、球蛋白、白蛋白和肌酐含量(P＜0.05),增加了总胆红素含量(P＜0.05);蛋鸡胰腺、脾脏、腿肌和胫骨指数均无显著差异(P＞0.05),但胫骨断裂所需做功有增加的趋势(0.05＜P＜0.1)。【结论】饲粮添加甲酸钙部分替代石粉不影响老龄蛋鸡生产性能,且能改善蛋鸡的健康和蛋壳品质,推荐添加量为0.5%。

【目的】旨在研究高、低营养水平饲粮对安黑杂交牛生长性能、养分消化和抗氧化性能的影响。【方法】采用对比试验设计,选取体况良好,体重(206.08 kg±21.87 kg)和月龄(6月龄左右)相近的安格斯(♂)×黑西门塔尔(♀)杂交牛12头(公母各半),随机分为2组,每组6头,分别饲喂高、低营养水平饲粮。其中,高营养水平配方在试验前(1~31 d)、后(32~62 d)期的综合净能(NE_mf)分别为5.77 和6.00 MJ/kg、粗蛋白质(CP)分别为12.47%和10.44%;低营养水平配方前、后期的NE_mf分别为5.42和 5.57 MJ/kg、CP分别为9.66%和9.05%。预试期12 d,正试期62 d,试验第1和62天测定体重和体尺;最后8 d进行消化试验,测定肉牛有机物(OM)、CP、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)消化率。【结果】试验全期,高营养水平组肉牛的平均日增重、平均日采食量和腹围显著高于低营养水平组(P＜0.05),分别高39.09%、22.20%和6.17%;料重比有低于低营养水平组的趋势(P=0.087)。饲粮营养水平对安黑杂交牛OM、CP、EE、NDF和ADF消化率没有显著影响(P＞0.05)。高营养水平组肉牛的血清总抗氧化能力显著低于低营养水平组(P＜0.05);血清谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛含量在两组间差异不显著(P＞0.05)。【结论】与低营养水平配方相比,高营养水平配方饲粮更能促进安黑杂交牛的生长发育。

【目的】高精料育肥引发的肉羊消化功能紊乱已引起了人们的高度重视,饲喂益生菌有助于羊的消化吸收。本研究将两种益生菌(地衣芽孢杆菌和丁酸梭菌)在饲粮中单独或联合添加,探究其对育肥羔羊生长性能、养分表观消化率及血清生化指标的影响。【方法】选择125只3~4月龄育肥后期湖羊公羔(30.89 kg±0.38 kg),随机分为5组:对照组、抗生素组(20 mg/kg莫能菌素)和3个益生菌组(4×10¹⁰CFU/kg地衣芽孢杆菌、2×10⁸CFU/kg丁酸梭菌和两种菌同剂量联合组),试验期60 d,测定试验前期(1~30 d)和后期(31~60 d)羔羊的生长性能、养分表观消化率,以及试验第1、30和60天羔羊的血清生化指标。【结果】与对照组相比,饲粮中单独或联合添加地衣芽孢杆菌和丁酸梭菌对羔羊平均日采食量均无显著影响(P＞0.05),但两种菌联合添加显著提高了羔羊整个试验期的日增重(P＜0.05),3个加菌组羔羊料重比(F/G)均显著降低(P＜0.05),且试验后期联合添加组的F/G显著低于两个单菌组(P＜0.05);两菌联合添加显著提高了羔羊试验前期和后期的干物质表观消化率(P＜0.05),3个加菌组前期的酸性洗涤纤维消化率均显著提高(P＜0.05)。另外,试验后期3个加菌组羔羊的血清葡萄糖含量较对照组提高了16.97%~28.18%,均差异显著(P＜0.05)。【结论】饲粮中单独添加或联合添加地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌均能提高羔羊的生长性能,改善消化性能,两菌联合添加效果较佳。

【目的】通过研究添加不同比例的马铃薯干对生长育肥猪的生长性能、胴体性状、肉品质和血常规指标的影响,探讨马铃薯在猪饲粮中替代玉米的适宜比例及对猪生长的影响,为马铃薯的猪用饲料化利用提供科学依据。【方法】将192头体重相近(33.0 kg±3.2 kg)的健康三元杂交(杜洛克猪×长白猪×大白猪)生长育肥猪,随机分为4组,每组6个重复,每个重复8头猪,公母各半。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别将基础饲粮中玉米总量占比的10％、20％、30％用等量的马铃薯干替代,饲喂120 d,测定各组猪的生长性能、胴体性状、背最长肌肉质性状和血常规指标。【结果】与对照组相比,饲粮中添加10％、20％和30％马铃薯干对育肥猪生长性能、胴体性状和血常规等大部分指标均无显著影响(P＞0.05);30％马铃薯添加组育肥猪的眼肌面积显著提高(P＜0.05),20%和30％马铃薯添加组背膘厚显著降低(P＜0.05);添加20％和30％马铃薯干显著提高背最长肌肌内脂肪含量(P＜0.05)和45 min肉色亮度(L^*值)(P＜0.05),显著降低肌肉剪切力(P＜0.05),肌肉滴水损失有随马铃薯含量升高而降低的趋势(0.05≤P＜0.1);10％马铃薯添加组育肥猪血液红细胞压积和红细胞分布宽度显著提高(P＜0.05)。【结论】添加10%的马铃薯干会显著提高部分与贫血相关的红细胞指标,添加20％、30％马铃薯干会显著降低生长育肥猪背膘厚,并增加肌内脂肪含量,降低肌肉剪切力。综合考虑,生长育肥猪饲粮中马铃薯干添加量以20％~30％为宜。

【目的】本试验旨在探究泌乳期伊犁马母马补喂不同剂量的支链氨基酸(BCAAs)对哺乳期马驹生长性能和粪便菌群的影响,为保障马驹哺乳期生长及健康提供参考依据。【方法】选择泌乳期母马及其马驹各20匹(哺乳期马驹在2~3月龄之间,初始体重为97.60 kg±13.24 kg;泌乳期母马体重为392.90 kg±12.18 kg),随机分成4组,每组母马及其马驹各5匹,分别为对照组和试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组,在相同饲养管理条件下饲养67 d(预饲期7 d,试验期60 d)。试验期间,对照组与试验组母马每天补喂精料补充料2 kg,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组母马分别额外补喂38、76、114 g/d BCAAs。试验前1 d和第60天测量马驹的体尺和体重数据,第60天采用直肠取粪法采集马驹粪便,分析马驹粪便菌群多样性。【结果】试验第60天,试验Ⅲ组马驹的胸围和体重显著高于对照组(P＜0.05),试验Ⅱ组马驹的体重显著高于对照组(P＜0.05);试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组和对照组粪便菌群OTUs数量分别为4 553、4 483、4 607和3 839。各组间Alpha多样性指数以及观测到的物种数均无显著差异(P＞0.05)。试验Ⅱ组马驹粪便螺旋体菌门相对丰度显著高于对照组和试验Ⅰ组(P＜0.05),毛螺旋菌科相对丰度显著高于对照组和试验Ⅲ组(P＜0.05);试验Ⅰ和Ⅱ组的瘤胃球菌科相对丰度均显著高于对照组(P＜0.05),试验Ⅲ组的理研菌科相对丰度显著高于对照组(P＜0.05)。在属水平上,试验Ⅱ组密螺旋体属的相对丰度最高且显著高于试验Ⅰ组(P＜0.05),且瘤胃球菌属相对丰度显著高于其他3个组(P＜0.05);试验Ⅲ组普氏菌科未分类菌004相对丰度极显著高于对照组和试验Ⅰ组(P＜0.01)。LEfSe分析与PICRUSt2功能预测所表现的差异项目均与肠道发酵代谢、短链脂肪酸的生产、氨基酸的代谢相关。【结论】给伊犁马母马补喂不同剂量的BCAAs可促进哺乳马驹胸围和体重的增长,提高其肠道有益菌群的丰度,降低有害菌群的丰度,以母马补喂76 g/d BCAAs效果最佳。

动物体内存在诸多微生物代谢产生的短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)、胆酸等生物活性物质。SCFAs主要由膳食纤维细菌发酵产生,既可以作为肠黏膜细胞的能量来源,也可以作为信号传递物质。SCFAs不仅可以调节肠道菌群、增强肠道屏障功能,而且可以通过多种途径参与神经系统的调节。因此,SCFAs被认为是影响宿主健康的重要因素。在全面禁抗背景下,寻找合适的抗生素替代品成为了研究的热点。外源添加适量SCFAs可以提高动物肠道有益菌的富集,增加紧密连接蛋白的表达,增强机体的免疫功能。此外,SCFAs在自闭症、抑郁症等疾病方面具有一定的治疗潜力。肠道微生物代谢产生的SCFAs大部分是乙酸、丙酸和丁酸,目前针对SCFAs的研究以丁酸居多,而对SCFAs混合物联合作用的研究相对较少,且应用领域还有待拓展。作者总结了SCFAs对动物肠道健康和肠脑信号传递的潜在影响以及可能的调控机制,为将SCFAs开发为一种外源添加剂或药物在调控动物健康和疾病治疗等方面推广应用提供理论依据。

近年来,膳食纤维(dietary fiber,DF)作为非粮型饲料资源在低蛋白质饲粮开发中成为研究热点,是猪饲粮的重要营养组分。大量研究证实,DF在调节猪肠道健康与缓解肠道疾病中发挥着多种作用,其作用机制十分复杂。DF通过筛选微生物菌群和维持肠道缺氧环境,调控肠道内微生物稳态;同时直接刺激免疫细胞、上调紧密连接蛋白的表达,发挥免疫调节作用。此外,DF还能增加隐窝数量和食糜黏度,其代谢产物为肠上皮细胞和共生微生物提供主要能源,促进肠道隐窝细胞和上皮细胞的发育和更新循环,从而改善肠道组织形态。作者系统整理与归纳了近年来的相关研究,综述了DF的定义、分类及其在预防猪肠道疾病上的研究结果。从优化菌群结构、改善黏膜屏障和肠道形态入手,分析了DF在调节猪肠道健康上的具体作用及可能机制,并提出了目前存在的问题及未来的研究重点,为后续深入研究DF对猪肠道健康的影响提供了新的视角和证据,同时为开发富含DF的非粮型饲料资源,发展节粮型、可持续型的绿色生猪养殖提供了理论依据。

【目的】研究饲粮中添加天蚕素抗菌肽对湖羊生长性能、血清免疫指标和抗氧化功能,及瘤胃菌群结构的影响。【方法】选取36只5月龄体重相近(33.47 kg±1.24 kg)的湖羊公羊随机分为2组,每组3个重复,每个重复6只羊。对照组(CON)饲喂基础饲粮;抗菌肽组(AMP)在基础饲粮中添加0.5 g/kg天蚕素抗菌肽。经过30 d饲养试验后采集血清样本和瘤胃液样本,测定羊的生长性能、血清免疫球蛋白、细胞因子含量和抗氧化功能以及瘤胃液菌群结构。【结果】AMP组湖羊的终末体重和平均日增重(ADG)显著高于CON组(P＜0.05),料重比(F/G)显著低于CON组(P＜0.05);AMP组湖羊血清中免疫球蛋白G(IgG)、IgM水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性及总抗氧化能力(T-AOC)显著高于CON组(P＜0.05),白细胞介素-6(IL-6)和抗肿瘤因子-α(TNF-α)水平显著低于CON组(P＜0.05);饲粮中添加天蚕素抗菌肽对湖羊瘤胃菌群丰富度指数Sobs指数、Chao1指数和Ace指数,以及多样性指数Shannon指数和Simpson指数均无显著影响(P＞0.05);AMP组湖羊瘤胃变形菌门和克里斯滕森菌属相对丰度均显著低于CON组,瘤胃Bacteroidales_RF16_group和norank_f__F082菌属以及NK4A214_group菌属相对丰度显著高于CON组(P＜0.05)。【结论】饲粮中添加0.5 g/kg天蚕素抗菌肽有利于提高育肥湖羊生长性能,增强免疫和抗氧化性能,降低炎症因子分泌水平,并且可以减少瘤胃有害细菌丰度,调节瘤胃微生物结构。

牦牛素有"高原之舟"的美誉,牦牛肉则是青藏高原牧民生活中最主要的肉类之一。牦牛肉具有高蛋白、低脂肪、富含多种氨基酸等特点,属于天然的绿色食品。受地理环境制约,牦牛只能生活在高海拔地区,生产规模一直无法扩大,牦牛肉产量无法提高,因此明析牦牛肉品质特性对于牦牛肉产品开发及肉品质调控具有重要的指导意义。牦牛品种多样,不同地区牦牛肉营养成分存在差异,不同品种牦牛肉的蛋白质、脂肪、矿物质及维生素等含量不同,不同年龄牦牛肉化学组成、pH、剪切力、滴水损失、蒸煮损失也不相同,肌肉部位不同造成相关指标存在差异;从食品安全性来说,牦牛肉中的重金属残留、微生物指标和兽药残留检测结果均符合国家标准,是消费者可选择的安全放心肉类。作者以近些年与牦牛肉品质相关的研究为基础,从营养品质、食用加工品质及安全性几方面系统综述了牦牛肉品质特性,结果表明牦牛肉具有营养价值高、安全无污染等优势,但同时具有感官、食用品质口感较差的缺点。但整体来讲,牦牛肉品质较好,但仍需进一步调控。

【目的】试验旨在探究补喂不同水平酵母培养物对泌乳母马产奶量、乳成分及血液生化指标的影响,以期为开发和使用饲料添加剂提高母马泌乳能力提供参考依据。【方法】选取8 h平均泌乳量为(2.65±0.34) kg、胎次和产驹日期相近、泌乳2月的伊犁马母马18匹,随机分为3组,分别为对照组、试验Ⅰ和Ⅱ组。其中,对照组马纯放牧饲养,试验Ⅰ和Ⅱ组在此基础上,分别补喂45和60 g/(d·匹)酵母培养物,预饲5 d后进行为期60 d的补喂试验。在正饲期前(记为第0天)、第30和60天(每天11:00、13:00、15:00、17:00),在每次挤奶时分别称量每匹马的挤奶量,并采集全天的乳样测定乳中乳蛋白、乳脂、乳糖、非脂固形物;于试验第60天晨饲前空腹采集血液样品,测定总蛋白(TP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆红素(T-Bil)等指标。【结果】①第0天时,各组之间产奶量均无显著性差异(P＞0.05)。第30天,试验Ⅱ组马产奶量显著高于对照组(P＜0.05);第60天,与对照组相比,试验Ⅰ和Ⅱ组马产奶量分别显著提高了19.33%和27.30%(P＜0.05)。②第0和30天,各组之间乳蛋白率、乳脂率、乳糖率及非脂固形物含量均无显著性差异(P＞0.05);第60天,与对照组相比,试验Ⅰ和Ⅱ组乳脂率分别显著提高了30.89%、35.77%(P＜0.05),试验Ⅱ组非脂固形物含量显著提高了1.90%(P＜0.05)。③与对照组相比,试验Ⅰ和Ⅱ组血浆中TP、ALB、GLB、UA、GLU、TG和T-Bil含量均无显著性差异(P＞0.05)。【结论】给泌乳母马补喂酵母培养物可以提高产奶量,改善乳成分质量,且补喂60 g/(d·匹)酵母培养物时效果较佳,但对血液生化指标没有显著影响。

【目的】探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在藏猪、川乡黑猪繁殖过程中的调控机理,筛选相关lncRNA。【方法】采集具有不同产仔数的藏猪和川乡黑猪妊娠期的子宫体组织作为样本,建立特异性猪子宫mRNA文库,利用Illumina PE150 HiSeq平台进行测序,测序结果经过质控、比对与拼接后,筛选出差异表达lncRNA并预测其靶基因,对靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。随机选取7个差异表达lncRNAs进行实时荧光定量PCR验证。【结果】在藏猪和川乡黑猪子宫体中存在32个共同差异表达lncRNAs,共得到168个靶基因。GO功能分析显示,不同繁殖能力的样本共同差异表达lncRNA的靶基因主要富集于分子代谢、转录活性调节、细胞增殖调节、子宫体修饰、微量元素代谢等条目中;KEGG通路分析显示,共同差异表达lncRNA的靶基因主要富集在糖酵解过程、卵母细胞分裂、细胞寿命调节、Ras信号通路、RIG-Ⅰ信号通路、FoxO信号通路、HIF-1信号通路、调控稳态过程等。实时荧光定量PCR结果显示,7个差异表达lncRNAs的表达与转录组测序结果一致。【结论】本研究在藏猪和川乡黑猪子宫体中发现了32个可能通过调控潜在靶基因参与母猪妊娠过程的lncRNAs,为进一步研究lncRNA在母猪繁殖过程中的调节机制提供了参考依据。这些lncRNA可作为新的繁殖性状生物标记用于猪的育种过程中。

【目的】本研究探索以机器学习方法对2个地方鸡品系周产蛋率建模,并将其与非线性回归方法比较,旨在提高养鸡生产中产蛋曲线的拟合精度。【方法】产蛋数据采集自地方鸡杂交组合试验群,自22周龄开始统计产蛋数,至50周龄截止。试验鸡于全封闭鸡舍单笼饲养,产蛋期人工补光16 h。试验鸡分为两组,每组150只鸡。第Ⅰ组是黄羽肉鸡合成系,第Ⅱ组是兼用型地方鸡种。以IBM SPSS Statistics 21.0软件中的非线性回归方法拟合产蛋曲线,所用模型包括Logistic模型、McNally模型、杨宁模型以及Grossman模型。以MATLAB R2014a构建机器学习模型,神经网络选用多层感知器,用300次迭代的拟牛顿法训练数据。以贝叶斯最小二乘支持向量机构建产蛋模型,针对正则项系数和核函数参数进行优化。【结果】依据MSE、R²、AIC评判标准,Grossman模型在4种非线性回归模型中拟合度最好,McNally模型表现最差。McNally模型预测的高峰产蛋率偏离真实值;Logistic模型、杨宁模型以及Grossman模型高峰产蛋率统计值与真实值基本相符。两组试验鸡的模型参数不同,Ⅱ组持续产蛋能力优于Ⅰ组。基于MSE、R²以及图形评估结果,神经网络优于传统的非线性方程拟合,而支持向量机略好于神经网络。优化后神经网络参数为2个隐藏层,每个隐藏层包含5个神经元。第Ⅰ组支持向量机的正则项系数为30.97,核参数为0.0701;第Ⅱ组支持向量机的正则项系数为566.53,核参数为0.1754.【结论】机器学习方法可用于产蛋模型构建,相比于传统单变量回归方法,机器学习方法可加入更多变量,提供更准确的预测。

【目的】利用全基因组选择信号检测方法探索中国地方猪基因组中与体型相关的候选基因,分析中国地方猪在进化和驯化过程中的受选择情况。【方法】基于310头地方猪的全基因组重测序数据,利用跨群体扩展单倍型纯合(cross population extended haplotype homozygosity,XP-EHH)和固定分化指数F_ST统计量(fixation index)两种方法进行全基因组选择信号检测。取两种方法各前0.1%位点的交集作为候选位点,分别向上、下游延伸200 kb作为潜在受选择区域。通过富集分析进一步探索选择信号的生物学功能。【结果】使用XP-EHH和F_ST两种方法共检测到633个潜在受选择位点,获得633个潜在区域,共注释到133个基因。数量性状基因座(quantitative trait locus,QTL)富集分析发现,不同体型中国地方猪之间的选择信号与肉质和胴体性状相关;染色质状态富集结果发现,不同体型中国地方猪群体之间的差异组织为内脏、消化系统和小脑。GO功能和KEGG通路富集分析发现16个基因在6个功能条目(P＜0.05,count＞3)上显著富集,主要集中在生长代谢相关通路,其中ACSM5、ACSM4、FXR1和FOXA2作为候选基因主要富集于脂肪酸合成与代谢、肌肉生长发育等信号通路。【结论】本研究采用两种选择信号检测方法对不同体型的中国地方猪进行了分析,筛选到一系列候选位点和基因,重点挖掘了参与猪生长发育的候选基因,如ACSM5、ACSM4、FXR1和FOXA2。

【目的】探究云上黑山羊主配公羊的亲缘关系及近交系数,构建肉羊高效联合育种体系,提升云上黑山羊生产性能和可持续发展力。【方法】采用简化基因组测序(genotyping-by-sequencing,GBS)技术对云上黑山羊5个核心育种场(XD、ZY、ML、SB、TJ)的100只主配公羊进行测序,并使用BWA、SAMTOOLS、PLINK v 1.90、Gmatrix v 2、Mega X等软件进行质控后高质量单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点鉴定、主成分分析(PCA)、状态同源距离矩阵(identical by state,IBS)和G矩阵构建、群体进化树分析、亲缘系数计算及近交系数估计。【结果】GBS质控后共获得215 926个高质量SNPs位点;共检测到8 692条连续性纯合片段(runs of homozygosity,ROH),长度在10.59~591.23 Mb之间,平均长度245.74 Mb。云上黑山羊主配公羊群体平均IBS遗传距离为0.118±0.011,亲缘关系G矩阵结果与IBS距离矩阵结果一致。结合群体进化树和亲缘关系分析,100只云上黑山羊被分为三大支和28个家系,其中家系2、11、13、14、16、17、18、20、23、24、25仅有1只公羊,XD、ZY、ML、SB、TJ核心育种场分别有18、10、8、5和8个家系;基于ROH的群体平均基因组近交系数为0.099641,29只公羊的近交系数＜0.0625,39只公羊的近交系数在0.0625~0.125之间,32只公羊近交系数＞0.125,存在较大的近交累积。【结论】100只云上黑山羊主配公羊被分为28个家系,其中11个家系仅有1只公羊,应加强繁育防止其血统的流失,配种方案制定中应关注近交系数＞0.125的个体,防止近交衰退,同时根据不同的育种目标合理进行种公羊的交换。

【目的】改进与优化鸡精液甘油细管简易冷冻保存技术。【方法】采用单因素设计试验,使用6%的冻存(3、6、9个月)与现配甘油保护液制作细管冷冻精液,比较冷冻精液冻后精子活力、活率及畸形率。采用液氮面上熏蒸法优化一步冷冻法冷冻速率,并用优化后一步冷冻法与前期研发的两步冷冻法制作细管冷冻精液,检测两种冷冻方案冻后与离心去甘油后的精子活力、活率、畸形率及种蛋受精率、孵化率。采用一步冷冻法冷冻不同品种公鸡精液,并采用不同输精轮次应用于不同年龄母鸡,通过输精试验评价输精效果。【结果】①添加冻存3、6、9个月的甘油保护液与现配甘油保护液冻后精子活力、活率、畸形率均无显著差异(P＞0.05)。②经优化和重复率比较后一步冷冻法最佳冷冻速率为细管精液距离液氮面3 cm冷冻3 min,样品精子活力≥60%的重复率为100%,精子活力≥65%的重复率为65%。③一步冷冻法精子活力、精子活率分别为62.84%和76.00%,均极显著高于两步冷冻法(58.17%和68.62%)(P＜0.01),两种冷冻方案的精子畸形率无显著差异(P＞0.05)。一步法、两步法冷冻精液离心去甘油前、后平均精子活力、种蛋平均受精率和平均孵化率均无显著差异(P＞0.05),单日最高受精率分别为68.34%和80.00%。④采用一步冷冻法制备的黑凤鸡与湘东鸡冻精输精后的种蛋受精率和孵化率均无显著差异(P＞0.05)。给30周龄母鸡输精后种蛋受精率极显著高于68周龄母鸡(P＜0.01)。3轮4次输精模式种蛋受精率极显著高于1轮2次输精模式(P＜0.01)。【结论】将甘油保护液制备成储备液在―20 ℃冻存,采用一步冷冻法并预先进行冷冻速率优化,输精时注意精液冷藏时长、母鸡年龄、输精轮次,能得到稳定较好的输精效果。

【目的】获得分化抗原163(cluster of differentiation 163,CD163)基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵过程中的作用。【方法】将靶向CD163基因第7外显子的sgRNA质粒(pX330-sgCD163)转染至iPAMs,转染48 h后通过有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型鉴定,通过Western blotting和脱靶分析来筛选CD163基因敲除的iPAMs;通过实时荧光定量PCR、Western blotting、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和半数细胞培养物感染量(50% tissue culture infective dose,TCID₅₀)等试验分析CD163基因敲除的iPAMs感染PRRSV的特征。【结果】测序结果表明,100株单克隆细胞中有1株CD163双等位基因敲除的iPAMs,敲除效率为1%;Western blotting结果显示,CD163基因敲除的iPAMs中检测不到CD163蛋白的表达,且在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。实时荧光定量PCR结果表明,与野生型iPAMs组相比,CD163基因敲除的iPAMs组病毒拷贝数极显著降低(P＜0.01);Western blotting和IFA结果表明,在接毒24 h后的CD163基因敲除的iPAMs组中未检测到PRRSV-N蛋白的表达;TCID₅₀试验结果同样显示,在CD163基因敲除的iPAMs组中未观察到细胞病变。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了CD163基因敲除的iPAMs,该细胞系可以完全抵抗PRRSV感染。该细胞系的建立为后续研究PRRSV与CD163蛋白的互作机制提供了新型试验材料。

【目的】比较哺乳期健康犊牛和感染牛诺如病毒(Bovine norovirus,BNoV)的腹泻犊牛粪便菌群多样性和物种组成,初步揭示BNoV感染的腹泻犊牛粪便菌群特征。【方法】首先应用PCR和RT-PCR法对健康和腹泻犊牛粪便中的腹泻相关病原进行检测,然后采用16S rRNA扩增子测序技术对病原检测阴性的健康犊牛粪便(H组)和仅BNoV检测阳性的腹泻犊牛粪便(BNoV组)的微生物多样性、菌群组成和功能进行比较分析。【结果】与H组相比,BNoV组粪便菌群操作分类单元(OTUs)数量和Chao1指数显著升高(P＜0.05),Shannon和Simpson指数极显著降低(P＜0.01)。与H组相比,BNoV组粪便变形菌门、埃希-志贺属、丁酸球菌属丰度极显著升高(P＜0.01),放线菌门、柯林斯菌属、巨球型菌属、厄氏菌属、双歧杆菌属、粪杆菌属等丰度极显著或显著降低(P＜0.01;P＜0.05)。双歧杆菌属、柯林斯菌属、巨球型菌属、厄氏菌属、粪杆菌属等在H组显著富集,而丁酸球菌属、埃希-志贺属、脆弱拟杆菌、梭菌属等在BNoV组显著富集。与H组相比,BNoV组粪便菌群胞内过程和信号传导、脂质代谢、新陈代谢、异生物质生物降解与代谢、萜类和聚酮类化合物代谢等显著或极显著上调(P＜0.05;P＜0.01),而膜转运、复制与修复、翻译、核苷酸代谢、遗传信息处理等显著或极显著下调(P＜0.05;P＜0.01)。【结论】感染BNoV的腹泻犊牛粪便菌群丰富度、多样性、物种组成和功能与健康犊牛显著不同,提示BNoV感染犊牛处于肠道菌群紊乱状态。

【目的】构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。【方法】本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T细胞表位进行预测分析,构建新的表位肽段,命名为PPT,通过ExPASy、VaxiJen、TMHMM、SOPMA、SOLpro和AlphaFlod2等在线软件对PPT进行生物信息学分析,并利用C-IMMSIM在线软件对其免疫反应进行模拟。通过T2A将PPT与PEDV的COE序列、TGEV的SAD序列及PDCoV的CTD序列连接并构建至真核表达载体pEGFP-N1,经PCR和双酶切鉴定正确后,将获得的重组质粒转染HEK293A细胞,经DAPI染色、CCK8、RT-PCR及Western blotting试验验证重组质粒在体外表达情况。【结果】构建的表位蛋白PPT由17条表位肽段组成,经生物信息学软件分析,该蛋白为非跨膜蛋白,结构稳定,具有抗原性和可溶性,亲水性高,无过敏性。C-IMMSIM结果显示,PPT能引起机体树突状细胞(DC)增加,B、T细胞免疫反应,刺激免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平升高。重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果显示,分别在3 359、2 375、1 064、944、764和467 bp出现特异性目的条带,与预期相符;重组质粒转染HEK293A细胞后,可见绿色荧光;RT-PCR扩增分别在3 359、2 375、1 064、944、764和467 bp处获得与目的基因大小相符的条带;CCK-8检测结果表明,重组质粒对细胞均无明显毒性作用;Western blotting检测结果显示,分别在31.7、16.1、37.9和27.5 ku处出现与目的蛋白分子质量大小一致的条带,重组质粒成功在HEK293A细胞中表达。【结论】本研究基于计算机软件分析设计的PPT表位蛋白成功构建三联疫苗,且在体外表达,为评价PEDV-TGEV-PDCoV三联表位疫苗的免疫效果提供依据。

【目的】克隆羊传染性脓疱病毒(ORFV)口唇和内脏感染株趋化因子结合蛋白(CBP)基因并进行生物信息学分析及原核表达,为后续研究CBP基因在ORFV免疫逃逸机制中的作用提供基础数据。【方法】以患病羔羊口唇结痂和小肠提取的DNA为模板设计特异性引物,进行PCR扩增并克隆测序,对表达的CBP基因遗传进化关系及蛋白理化性质、结构特点进行分析;利用原核表达系统pGEX-4T-1构建重组质粒pGEX-4T-1-CBP-K、pGEX-4T-1-CBP-N并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,并通过Western blotting对蛋白进行抗原性分析。【结果】经测序,ORFV口唇感染株CBP基因全长873 bp,内脏感染株CBP基因全长846 bp,且后者在第217 bp处有24 bp碱基的丢失。系统进化树显示,口唇与内脏感染株不属于同一进化分支,遗传距离较远;口唇感染株CBP基因与中国吉林分离株亲缘关系最近;内脏感染株CBP基因与马来西亚分离株亲缘关系最近。口唇感染株CBP基因编码291个氨基酸,内脏感染株CBP基因编码282个氨基酸,蛋白二级结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构有5处差异,主要是α-螺旋和β-折叠的变化。试验成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-CBP-K和pGEX-4T-1-CBP-N,其在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中以包涵体形式表达CBP融合蛋白,分子质量约为60 ku。【结论】本研究内脏感染株与口唇感染株相比,存在24 bp的缺失,并成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-CBP-K和pGEX-4T-1-CBP-N,可在大肠杆菌中表达CBP融合蛋白。本研究结果为揭示CBP在ORFV与宿主互作中发挥的作用提供参考,也可为寻找新的羊传染性脓疱防治方法提供依据。

【目的】沙门菌是常见的人畜共患病原菌,可引发多种食源性疾病,鼠伤寒沙门菌是沙门菌的重要血清型之一,具有重要的公共卫生研究意义。本试验旨在研究转运蛋白相关基因oppCDF对鼠伤寒沙门菌生物特性的影响,为新型沙门菌减毒疫苗的制备提供理论基础。【方法】本试验通过比较鼠伤寒沙门菌野生株及已成功构建的oppCDF基因缺失株的生化特性、遗传稳定性、耐药性、黏附性、侵袭力、半数致死量(LD₅₀)及小鼠肝脏、脾脏载菌量,分析oppCDF基因与鼠伤寒沙门菌生物特性之间的关系。【结果】oppC、oppD和oppF基因分别缺失后鼠伤寒沙门菌生化特性未发生明显改变且能稳定遗传,表明oppCDF基因表型未发生变化;与野生株STM LT2相比,基因缺失株STM LT2ΔoppC对红霉素变为敏感、氯霉素敏感性降低,STM LT2ΔoppD对头孢氨苄敏感性降低,STM LT2ΔoppF对复方新诺明敏感性增强,3株基因缺失株均对氨苄西林不敏感。3株基因缺失株LD₅₀检测结果显示,与野生株STM LT2相比,STM LT2ΔoppC毒力下降,但STM LT2ΔoppD、STM LT2ΔoppF毒力分别上升1.6和8.6倍;STM LT2ΔoppC的黏附性显著降低(P＜0.05),侵袭力降低,定植力极显著下降(P＜0.01);STM LT2ΔoppD的黏附性、侵袭力降低,但定植力极显著上升(P＜0.01);STM LT2ΔoppF的黏附性显著降低P＜0.05),但侵袭力显著增强P＜0.05),定植力极显著上升(P＜0.01)。【结论】oppC基因缺失可降低鼠伤寒沙门菌的致病性,但oppD、oppF基因缺失可增强鼠伤寒沙门菌的致病性,以上结果为沙门菌的致病机制研究提供了理论基础。

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的母猪严重繁殖障碍与仔猪呼吸困难的一种全球性疾病。感染PRRSV所引起疾病的严重程度与病毒载量和体内产生的细胞因子有关。PRRSV通过自身编码的结构蛋白和非结构蛋白激活炎症信号通路,导致大量细胞因子、趋化因子释放从而诱导炎症反应,但过度炎症反应特别是细胞因子风暴可能导致严重的组织损伤,导致病情加剧。因此通过抑制PRRSV引起的炎症应答可能是有效预防和控制PRRS的主要策略。目前常用的抗炎药物包括重组干扰素、非甾体抗炎药(NSAID)和类固醇等,传统的中药制剂也被证实对PRRS有一定治疗效果。然而PRRSV感染诱导炎症反应的具体条件、程度和机制以及抗炎药物作用尚未清楚。笔者拟对PRRSV诱导的炎症反应及其作用机制,以及相关抗炎药物的开发应用进行综述,以期为PRRS的预防和控制提供新的思路。

【目的】拟分离1株可裂解多重耐药大肠杆菌的噬菌体,明确其生物学特性及基因组特征。【方法】本研究从病死山羊肺脏组织中分离大肠杆菌,并通过药敏试验分析其耐药性。以大肠杆菌ER2738菌株为宿主菌,从养殖场污水中进行噬菌体的初步增殖,通过点滴法确定分离噬菌体的宿主谱,采用双层琼脂平板法分离纯化特异性裂解大肠杆菌的噬菌体,进一步对其形态、最佳感染复数(MOI)、生长曲线、酸碱度和温度耐受性等生物学特性进行研究;通过高通量测序平台测定其全基因组序列,并对其基因组及遗传进化特征进行分析。【结果】从病死山羊肺脏中分离到1株多重耐药性大肠杆菌,命名为YNEC001。从养殖场污水中分离到1株可特异性裂解YNEC001菌株的噬菌体BP32,电镜观察显示噬菌体BP32属于肌尾科噬菌体,最佳MOI为0.1,潜伏期约为30 min,爆发期持续约60 min,裂解量约为660 PFU/cell,在30~50 ℃和pH 4.0~10.0条件下可保持稳定的活性。噬菌体BP32基因组长度为166 346 bp,GC含量偏低(35.42%),未发现耐药基因和毒力因子,基因组共包含261个开放阅读框(ORF),其中125个为已知功能基因,含有8个tRNA。在全基因组水平上,噬菌体BP32与肠杆菌噬菌体Escherichia phage BF15(MW822007)核苷酸序列相似性最高(98.25%),但基于末端酶大亚基序列的进化分析则表明BP32与大肠杆菌噬菌体Escherichia phage vB_EcoM_SP1(MT682709)的亲缘关系最近,而与Escherichia phage BF15(MW822007)的关系较远。【结论】本研究分离到1株多重耐药大肠杆菌YNEC001,并分离到可特异性裂解YNEC001菌株的噬菌体BP32,该噬菌体具有较强的裂解能力和良好的稳定性,具备开发为耐药性大肠杆菌治疗制剂的潜力。

【目的】基于试验设计构建连蒲双清散抗炎抑菌的谱效关联分析,并结合网络药理及体内外试验揭示其药效物质基础及作用机制。【方法】选取黄连蒲公英比例、提取酸浓度、乙醇浓度为影响因素针对性设计L₉(3⁴)正交试验,得到9种连蒲双清散提取物,采用高效液相色谱(HPLC)法建立连蒲双清散不同提取物的指纹图谱;以脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞炎症指标和对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径作为药效学评价指标,开展连蒲双清散的体外药效学研究;采用灰色关联度分析法及偏最小二乘回归分析法建立谱效关系,筛选出其发挥抗炎药效和对金黄色葡萄球菌有抑菌效果的药效物质。通过网络药理手段从另一个层面筛选药效成分和靶点,并通过体内试验对谱效分析和网络药理学的结果进行验证。【结果】HPLC指纹图谱识别出9个共有峰,并鉴定出4种组分(菊苣酸、黄连碱、表小檗碱和巴马汀)。正交试验结果显示,黄连中的成分对金黄色葡萄球菌的抑菌效果起主导作用,而蒲公英对抗炎药效的发挥作用更明显。谱效分析筛选出表小檗碱和黄连碱是连蒲双清散的部分药效物质基础。网络药理学挖掘出表小檗碱、巴马汀、黄连碱、木犀草素和咖啡酸是网络中权重最高的5个成分,白细胞介素-6(IL6)和肿瘤坏死因子(TNF)是其中2个主要的作用靶点;分子对接结果显示,5个化合物与2个靶点蛋白结合能均低于－5 kJ/mol,对接良好。小鼠急性肠炎模型中,病理切片显示,经连蒲双清散治疗后的小鼠结肠中炎症细胞浸润病变面积明显减少;ELISA检测结果显示,药物组与模型组小鼠结肠中炎症因子表达量具有显著差异(P＜0.05)。【结论】基于试验设计的谱效关联分析结合网络药理学有效挖掘出连蒲双清散发挥抗炎作用和对金黄色葡萄球菌有抑菌效果的主要药效物质是表小檗碱和黄连碱,主要作用靶点是IL6和TNF。本研究为探讨复方中药的药效物质基础及作用靶点提供了有意义的尝试。

【目的】为合理防控沙门菌感染,本试验针对甘肃省及周边地区畜禽屠宰及市售环节沙门菌的感染情况开展研究。【方法】通过细菌分离培养、生化试验及分子生物学方法进行细菌分离鉴定,采用玻片凝集法和多位点序列分型(MLST)确定沙门菌血清型。采用结晶紫染色定量法评价分离株生物被膜形成能力,通过药敏试验检测分离菌对常用抗菌药的敏感性,评估4种市售消毒剂对沙门菌的灭菌效果,并确定其最小抑菌浓度(MIC)。【结果】细菌分离培养结果显示,疑似沙门菌分离株在BS平板上菌落呈黑色有金属光泽、棕褐色或灰色;在XLD平板上菌落有光泽且中心呈黑色,或呈现全部黑色的菌落;镜检显示为革兰阴性短杆菌。生化鉴定结果显示,分离菌硫化氢、葡萄糖、鸟氨酸、赖氨酸脱羧酶反应结果呈阳性;尿素酶、氰化钾、乳糖、蛋白胨水反应结果呈阴性。PCR扩增沙门菌特异性基因invA获得大小约为284 bp的目的条带,共分离到95株沙门菌,均属于肠道沙门菌的3种血清型——鼠伤寒沙门菌、德尔卑沙门菌、里森沙门菌。多位点序列分型共鉴定出3种,分别为ST34、ST469、ST40型。所有分离株均可形成生物被膜。药敏试验结果显示,所有菌株对米诺环素、万古霉素完全耐药,对阿米卡星、头孢曲松、卡那霉素、头孢唑啉、头孢氨苄、庆大霉素等敏感性较强,75.78%的菌株具有多重耐药性。4种消毒剂对分离株MIC存在差异,0.2%甲醛溶液的MIC为0.125~0.25 mg/mL,0.2%苯扎溴铵的MIC为0.0625~0.125 mg/mL,0.5%碘溶液的MIC为0.3125~0.625 mg/mL,2%氢氧化钠的MIC为1.25~2.5 mg/mL。【结论】德尔卑沙门菌、鼠伤寒沙门菌和里森沙门菌是当前屠宰场中沙门菌的主要血清型,具有生物被膜形成能力和多重耐药性,给公共卫生带来很大威胁。本研究为加强甘肃省及周边地区屠宰场及市售环节卫生管理提供科学依据。

【目的】牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是犊牛腹泻和上呼吸道疾病的主要病原,目前缺少敏感的适合BCoV体外培养的本动物细胞,限制了BCoV致病机制的深入研究。因此,本研究拟从犊牛肺脏组织中分离出牛肺上皮细胞(bovine lung epithelial cell,BLEC)建立BCoV体外感染本动物细胞模型。【方法】采用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原蛋白酶两步酶消化法对新生犊牛肺脏组织进行肺上皮细胞初步提取,再利用上皮细胞贴壁时间不同的差异贴壁法纯化BLEC。通过间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)检测纯化后细胞中标志细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK-18)的表达来鉴定BLEC,并通过PCR方法对细胞进行病原纯净性检测,包括牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)、BPIV5、牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、BCoV和支原体(Mycoplasma)。通过PCR和IFA检测BCoV对BLEC的易感情况,并绘制BCoV在BLEC上的一步生长曲线。【结果】分离纯化培养的BLEC形态均匀稳定、呈菱形或砖块状,无常见病原BRV、BVDV、BPIV3、BPIV5、IBRV、BCoV和支原体污染,上皮细胞标志CK-18呈阳性表达。犊牛腹泻来源的BCoV HLJ-325毒株感染BLEC 24 h后可观察到明显的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE);PCR能扩增出BCoV N基因;IFA结果显示,BCoV感染BLEC呈现特异性红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测BCoV 含量建立病毒生长曲线,BCoV在感染BLEC后20 h时病毒载量最高,为4.46×10⁵拷贝/mL。【结论】本研究成功分离制备了BLEC,证明BCoV易感染BLEC,构建了BCoV体外感染BLEC模型,为研究BCoV引起牛呼吸道疾病的致病机制奠定基础。

【目的】调查鸡肠道内大肠杆菌分泌肠菌素的水平,以及其对空肠弯曲菌的促生长作用。【方法】利用间接竞争ELISA(ic-ELISA)方法检测临床分离的30株鸡肠道大肠杆菌分离株的肠菌素产量;利用λRed同源重组系统构建大肠杆菌entB基因缺失突变株,并用ic-ELISA方法测定大肠杆菌亲本株和突变株的肠菌素产量;检测亲本株和突变株在不同限铁培养基中的生长曲线;将大肠杆菌亲本株和突变株培养上清接种空肠弯曲菌,探究大肠杆菌肠菌素对空肠弯曲菌生长的影响。【结果】30株鸡肠道大肠杆菌分离株分泌肠菌素水平介于11~126 μmol/L之间。利用λRed同源重组系统成功构建2株大肠杆菌entB基因缺失突变株。定性结果显示,大肠杆菌亲本株在CAS培养基中产生黄色晕圈,而entB基因缺失株不产生晕圈。ic-ELISA检测结果显示,亲本株分泌肠菌素浓度为100~150 μmol/L,而基因缺失株未检测出肠菌素。大肠杆菌亲本株和entB基因缺失株在富铁培养基中生长无显著差异(P＞0.05),在限铁培养基中达到平台期的D_600nm值分别为0.6和0.3。促生长试验结果显示,大肠杆菌亲本株培养上清接种空肠弯曲菌24和36 h,菌落数分别为7.8和8.2 lg CFU/mL,而entB基因缺失株培养上清接种后菌落数分别为7.0和7.3 lg CFU/mL。【结论】大肠杆菌具有分泌肠菌素的能力,且其在限铁环境下能促进空肠弯曲菌的生长,试验结果为深入研究肠菌素介导的肠道细菌之间的相互作用奠定基础。

【目的】探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对顺铂(cisplatin,CIS)诱导的大鼠急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的保护效果和作用机制,以期为CIS和EGCG的临床用药提供试验基础。【方法】选取40只雄性Wistar大鼠,随机均分为5组。CON和CIS组大鼠灌胃生理盐水;EGCG、CE和抑制剂组大鼠灌胃40 mg/kg EGCG,连续28 d;在第26天,CIS、CE及抑制剂组大鼠腹腔注射7 mg/kg CIS,CON和EGCG组大鼠注射等量生理盐水,此外抑制剂组大鼠腹腔注射5 mg/kg LY294002,连续3 d。第29天采集所有大鼠的肾脏组织,采用HE染色及透射电镜观察肾脏组织病理和细胞线粒体形态变化;利用Western blotting检测各组大鼠肾脏中自噬蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ、ATG5、ATG12、Beclin-1、p62)、通路蛋白(PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt)的表达情况;通过免疫荧光法检测肾脏中自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62的表达水平。【结果】HE染色及透射电镜结果显示,预处理EGCG缓解了CIS诱导大鼠肾小管上皮细胞坏死和脱落、炎性细胞浸润及细胞线粒体肿胀变性和线粒体嵴断裂。Western blotting结果显示,与CON组相比,CIS组大鼠肾脏中LC3Ⅱ/Ⅰ、ATG5、ATG12、Beclin-1表达量极显著升高(P＜0.01),p62、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt表达量极显著降低(P＜0.01),而预处理EGCG组逆转了这一现象。免疫荧光结果显示,与CE组相比,抑制剂组大鼠病理损伤加重,LC3Ⅱ/Ⅰ荧光信号增强,p62荧光信号减弱。【结论】预处理EGCG可以通过激活PI3K/Akt信号通路抑制细胞自噬,从而缓解CIS诱导的大鼠AKI,而这种保护作用可以被PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002抵消。

【目的】了解河曲马源大肠杆菌的耐药情况,为兽医临床合理使用抗菌药物提供基础理论指导。【方法】采用细菌形态学、革兰染色镜检、16S rDNA序列分析等方法进行细菌分离鉴定。采用微量肉汤稀释法和PCR扩增方法对分离鉴定的大肠杆菌进行抗菌药物敏感性试验及耐药基因、整合酶基因、外排泵基因携带情况检测。同时,采用改良结晶紫半定量方法进行生物被膜形成能力测定。利用棋盘法测定13种外排泵抑制剂与多西环素联用对生物被膜的清除作用。【结果】分离株在伊红-美蓝琼脂培养基上为具有绿色金属光泽的紫黑色菌落,在大肠杆菌/大肠菌群显色培养基上为蓝色菌落,革兰染色镜检可见粉红色短杆状细菌。经16S rDNA测序比对与大肠杆菌高度相似的分离株为64株。64株大肠杆菌分离株对酰氨醇类、磺胺类及利福霉素类药物耐药率相对较高并出现多重耐药菌株,其中20.31%(13/64)表现出对5类抗菌药物耐药;检测到21个耐药基因、1个整合酶基因及6个外排泵基因为阳性;整合酶基因intl1检出率为89.06%。生物被膜形成能力为强、中、弱及无成膜能力的大肠杆菌分别为8(12.50%)、34(53.13%)、20(31.25%)和2(3.12%)株。外排泵抑制剂与多西环素联合能增强对生物被膜的清除能力。【结论】河曲马源大肠杆菌耐药较为严重,应进一步加强青海省河南蒙古族自治县赛马的用药监管力度,减少或避免多重耐药菌株的出现及耐药性广泛传播。

【目的】明确1例犬泌尿生殖道感染的发病原因。【方法】无菌采集病犬尿液,通过细菌分离纯化、革兰染色镜检、生化试验、16S rRNA基因扩增进行鉴定,同时经药敏试验、毒力基因和耐药基因检测及细菌致病性试验测定纯化菌株的生物学特征。【结果】分离得到1株兼性厌氧型革兰阳性球菌;菌落形态如针尖大小、表面光滑、半透明、圆形凸起、边缘整齐;生化鉴定结果显示,致病菌能发酵乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、精氨酸,不能发酵木糖、氧化酶、枸橼酸盐、棉籽糖和鸟氨酸脱羧酶;16S rRNA基因序列与已发表的粪肠球菌序列相似性高于99%,鉴定为粪肠球菌,并将其命名为EFGZ23GY01;药敏试验结果显示,分离株仅对万古霉素及氯霉素敏感,对新霉素中度敏感,对克林霉素等25种药物耐药;8种粪肠球菌毒力基因检测结果显示,分离株携带efaA、ace、asa1及gelE毒力基因;14种耐药基因检测结果显示,分离株携带tetL、sulⅠ、tetC、bla_TEM、bla_OXA-23、aadA1和sulⅢ耐药基因;致病性试验结果显示,5只小鼠注射菌液12 h后出现精神萎靡,被毛杂乱等症状,未出现死亡,48 h后死亡1只,表明分离菌对小鼠具有致病性。【结论】本研究成功从犬尿液种分离得到1株粪肠球菌,其携带多种毒力基因和耐药基因,且对小鼠有致病性,研究为病犬的后续治疗提供了参考。

【目的】探究牛支原体石河子分离株感染牛巨噬细胞(BoMac)能否通过线粒体凋亡途径影响细胞增殖活力和凋亡。【方法】通过培养基培养及测定颜色变化单位(CCU)绘制牛支原体菌株生长曲线,确定其最高活力的培养时间;使用处于活力最高时的牛支原体以不同感染复数(MOI)和不同感染时间感染牛巨噬细胞,分别利用实时荧光定量PCR和Western blotting试验检测线粒体凋亡通路核心分子Bax和Bcl-2的表达情况,通过CCK8试验检测细胞增殖活力水平,流式细胞术检测细胞凋亡率。【结果】生长曲线分析结果显示,牛支原体石河子分离株12~54 h处在对数生长期,54~84 h处在平台期(滴度为10⁹ CCU/mL),因此,选用培养54 h的牛支原体石河子分离株感染细胞。实时荧光定量PCR与Western blotting检测结果一致,即随感染时间和MOI的增加,促凋亡蛋白Bax基因及其蛋白表达量呈现上升趋势,抑凋亡蛋白Bcl-2基因及其蛋白表达量呈现下降趋势,其中牛支原体石河子分离株感染24 h时,Bax基因表达量极显著增加(P＜0.01),Bcl-2基因表达量显著降低(P＜0.05),Bcl-2/Bax显著下降(P＜0.05);当MOI为1 000时Bax蛋白表达量极显著增加(P＜0.01),Bcl-2蛋白表达量显著降低(P＜0.05),Bcl-2/Bax极显著下降(P＜0.01)。CCK8试验结果显示,随着感染时间和MOI的增加,牛巨噬细胞活力极显著降低(P＜0.01),增殖抑制率为35%~45%。流式细胞术检测结果显示,感染后,牛巨噬细胞凋亡率为25%~45%。【结论】随着感染时间和MOI的增加,牛支原体石河子分离株可通过线粒体凋亡途径标志因子Bax和Bcl-2的表达诱导牛巨噬细胞凋亡,为进一步解析牛支原体的致病机制提供理论基础。

【目的】本试验通过过表达miRNA-424-5p,明确miRNA-424-5p与其靶基因丝氨酸/苏氨酸激酶3(AKT serine/threonine kinase 3,AKT3)对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡影响的机制,为阐明miRNA-424-5p在奶牛胎盘分离过程中的作用机制提供试验基础和理论依据。【方法】试验分为3组:空白对照组(Control)、阴性对照组(miRNA-424-5p mimics NC)和过表达组(miRNA-424-5p mimics)。采用茎环法实时荧光定量PCR检测转染miRNA-424-5p mimics后奶牛子宫内膜上皮细胞miRNA-424-5p的表达变化;采用Western blotting及实时荧光定量PCR检测过表达后AKT3和凋亡相关因子的表达变化,采用Annexin V-FITC/PI法检测奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡情况。【结果】与空白对照及阴性对照组相比,转染miRNA-424-5p mimics后子宫内膜上皮细胞miRNA-424-5p mRNA的表达量极显著升高(P＜0.01),B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2,Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase3)和Caspase9的mRNA表达量极显著升高(P＜0.01),AKT3和Bcl-2的mRNA表达量极显著降低(P＜0.01);Bax和Caspase3蛋白表达量极显著升高(P＜0.01),Caspase9蛋白表达量显著升高(P＜0.05),AKT3和Bcl-2 蛋白表达量极显著降低(P＜0.01);细胞凋亡率极显著升高(P＜0.01)。【结论】过表达miRNA-424-5p可通过靶向调控AKT3使奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡因子Bax、Caspase3和Caspase9的表达量增加,使Bcl-2的表达量降低,进而促进细胞凋亡。

【目的】探究桑叶多糖(mulberry leaf polysaccharide,MLP)对猪肺泡巨噬细胞免疫功能的影响及其作用机制。【方法】以猪肺泡巨噬细胞为研究对象,通过CCK-8方法检测不同浓度MLP作用后猪肺泡巨噬细胞的增殖率,筛选MLP的适宜作用浓度。将细胞分成空白对照组(BC组)、阳性对照组(LPS组)和不同浓度MLP组,通过Griess法检测猪肺泡巨噬细胞中一氧化氮(NO)释放量;利用中性红吞噬试验检测猪肺泡巨噬细胞吞噬能力;使用ELISA法测定猪肺泡巨噬细胞中白细胞介素-10(IL-10)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;利用实时荧光定量PCR检测TNF-α、Toll样受体4(TLR4)、IL-6、IL-10以及核转录因子κB(NF-κB)的mRNA表达量;通过Western blotting检测猪肺泡巨噬细胞中TLR4和p65蛋白表达量。【结果】与0 μg/mL MLP组相比,MLP浓度为20、40和80 μg/mL时猪肺泡巨噬细胞增殖率极显著升高(P＜0.01),且呈剂量依赖性,后续选择20、40和80 μg/mL MLP进行试验。与BC组相比,不同浓度MLP组猪肺泡巨噬细胞吞噬率和NO释放量极显著升高(P＜0.01)。ELISA检测结果显示,MLP浓度为80 μg/mL时,猪肺泡巨噬细胞中IL-6和TNF-α含量显著或极显著高于BC组(P＜0.05;P＜0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,MLP浓度为40和80 μg/mL时,猪肺泡巨噬细胞中TNF-α、IL-6和TLR4基因mRNA表达量均极显著高于BC组(P＜0.01)。Western blotting检测结果显示,MLP浓度为80 μg/mL时,猪肺泡巨噬细胞中p65和TLR4蛋白表达量极显著高于BC组(P＜0.01)。【结论】MLP能激活猪肺泡巨噬细胞,显著促进NO的释放以及IL-6、TNF-α的分泌,具有良好的免疫调节活性,其免疫调节机制与巨噬细胞表面TLR4的激活相关。

【目的】研究桂郁金醇提物对脂多糖(LPS)致小鼠急性肺损伤(ALI)的保护作用。【方法】将54只雄性昆明小鼠随机分成6组:空白组、模型组、地塞米松阳性对照组及桂郁金醇提物低(2 g/kg)、中(4 g/kg)、高(40 g/kg)剂量组,每组9只。给药组小鼠分别灌胃给予地塞米松(5 mg/kg)或相应浓度桂郁金醇提物混悬液(0.2 mL/10 g),空白组和模型组小鼠灌胃给予相应体积的0.5%羧甲基维生素钠(CMC-Na),连续灌胃5 d。末次给药1 h后,除空白组外,其余各组小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS,12 h后麻醉并处死小鼠,剖取肺脏组织。试验中观察造模前后小鼠一般情况变化,统计小鼠体重变化、肺脏指数,测定肺脏重湿/干比。通过HE染色观察小鼠肺脏组织病理学变化并进行肺损伤评分;利用实时荧光定量PCR检测肺脏组织中炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、髓样分化因子88(MyD88)、Toll样受体4(TLR4)、核转录因子κB(NF-κB)mRNA表达水平。【结果】与空白组相比,模型组小鼠体重增长率极显著下降(P＜0.01),肺脏指数、肺脏重湿/干比和肺损伤总评分均极显著升高(P＜0.01),肺脏组织相关炎症因子mRNA相对表达量均显著或极显著增加(P＜0.05;P＜0.01),成功构建ALI小鼠模型。与模型组相比,桂郁金醇提物各剂量组小鼠体重增长率显著或极显著升高(P＜0.05;P＜0.01);桂郁金醇提物中、高剂量组小鼠肺脏指数、肺脏重湿/干比均显著或极显著降低(P＜0.05;P＜0.01);桂郁金醇提物高剂量组小鼠肺损伤总评分和肺脏组织中TNF-α、IL-6基因mRNA表达量显著降低(P＜0.05);桂郁金醇提物中剂量组小鼠肺脏组织中NF-κB基因mRNA表达量显著降低(P＜0.05)。【结论】桂郁金醇提物对LPS诱导的小鼠ALI具有保护作用,其作用机制可能与桂郁金醇提物减轻TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导的炎症损伤有关。

【目的】阐明健脾祛湿方(Jianpi Qushi decoction,JQD)治疗大鼠非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的药效和分子机制。【方法】试验通过饲喂高脂饲料建立大鼠NAFLD模型,将大鼠随机分为模型、奥利司他(32.4 mg/kg)和JQD低(0.35 g/kg)、高(0.70 g/kg)剂量组,另设对照组,每组6只。奥利司他和JQD不同剂量组大鼠灌胃给药,1 mL/只,每天1次,连续7周,对照组与模型组大鼠灌胃等剂量的生理盐水。试验结束后采集大鼠血液、肝脏组织。通过ELISA法测定大鼠血清血脂水平,主要包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C);统计大鼠肝脏指数,检测肝脏抗氧化指标(谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA));采用HE染色和油红O观察大鼠肝脏组织形态结构。利用药物和疾病靶点相关数据库分析JQD治疗NAFLD的活性成分和关键靶点;通过Cytoscape 3.7.2软件构建"药物-成分-靶点"网络图;通过分子对接和实时荧光定量PCR验证JQD主要活性成分和关键靶点的作用效果。【结果】与对照组相比,模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C和肝脏中MDA含量及肝脏指数均显著或极显著升高(P＜0.05;P＜0.01),血清中HDL-C含量和肝脏中GSH含量及SOD、CAT活性均显著或极显著降低(P＜0.05;P＜0.01)。与模型组比,JQD低、高剂量组大鼠血清中TC、TG含量和肝脏中MDA含量及肝脏指数均显著降低(P＜0.05),肝脏中SOD、CAT活性和GSH含量均显著升高(P＜0.05)。HE染色和油红O染色结果显示,对照组大鼠肝细胞形态正常,肝索整齐;模型组大鼠肝脏发生明显的脂肪变形,肝细胞萎缩,布满大小不一的空泡,肝索形态紊乱;JQD低、高剂量组大鼠肝脏空泡数量明显减少,肝索清晰可见。网络药理学共筛选出JQD的有效活性成分35个和NAFLD疾病靶点1 890个;网络拓扑分析结果显示,JQD治疗NAFLD的核心活性成分为山柰酚、异鼠李素和槲皮素等,其核心治疗靶点为肿瘤坏死因子(TNF)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)和血管内皮生长因子A(VEGFA)等。分子对接结果显示,核心活性成分和关键靶点的结合能均＜―5.0 kJ/mol,相互之间具有较好结合活性。实时荧光定量PCR结果显示,与模型组相比,JQD低、高剂量组大鼠肝脏中TNF和PPARG基因表达量均极显著降低(P＜0.01),JQD高剂量组VEGFA基因表达量极显著降低(P＜0.01)。【结论】JQD对NAFLD显示出良好的治疗效果,其作用机制可能与降低血脂水平、提高肝脏抗氧化酶活性有关。

【目的】探究金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌对奶牛外周血中性粒细胞(PMNs)活力以及炎性因子分泌的影响。【方法】以体外培养的奶牛外周血PMNs为研究对象,用姬姆萨和台盼蓝染色对分离培养的奶牛PMNs进行形态鉴定和细胞活率检测,确定奶牛外周血PMNs的最佳作用时间。构建金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌诱导的奶牛外周血PMNs感染模型,测定奶牛外周血PMNs对两种细菌的杀伤能力;利用CCK-8法测定奶牛PMNs活力,用ELISA法检测细胞中炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-8和IL-10含量。【结果】体外分离培养的奶牛外周血PMNs纯度达99%,其存活率随培养时间延长逐渐降低,24 h内存活率达85%以上。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌对数生长期分别为4~7和4~8 h,二者感染奶牛PMNs后,当MOI为10时,2、4、6 h时金黄色葡萄球菌存活率极显著高于表皮葡萄球菌(P＜0.01)。与对照组相比,金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染PMNs不同时间点细胞中TNF-α、IL-8含量均极显著或显著升高(P＜0.01;P＜0.05);感染3、6、12、24 h时细胞中IL-10含量极显著或显著升高(P＜0.01;P<0.05);感染6、9、12、24 h时细胞中IL-1β含量极显著或显著升高(P＜0.01;P＜0.05)。与金黄色葡萄球菌组相比,感染3 h时表皮葡萄球菌组细胞中TNF-α含量极显著降低(P＜0.01),IL-10、IL-8含量极显著或显著升高(P＜0.01;P＜0.05);感染6 h时表皮葡萄球菌组细胞中TNF-α、IL-1β含量极显著降低(P＜0.01);感染9 h时细胞中TNF-α、IL-8含量极显著或显著升高(P＜0.01;P＜0.05)。【结论】金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌均能逃避奶牛外周血PMNs的吞噬和杀伤作用,二者感染后细胞活力显著降低,能通过调控PMNs中炎性因子的分泌介导先天免疫应答反应,试验结果为靶向PMNs筛选金黄色葡萄球菌性的奶牛乳房炎抗性相关的候选因子研究奠定基础。

【目的】探究冬季叠层笼养肉鸡舍内氨气(NH₃)、二氧化碳(CO₂)和空气颗粒物浓度分布特征,为立体养殖鸡舍环境均匀度控制提供基础参数。【方法】2022年11月22日—2022年12月30日,以豫北某叠层笼养肉鸡舍(科宝白羽肉鸡)为研究对象,在7、14、21、28和35日龄,分别于06:00、09:00、12:00、15:00和18:00测量舍内15个不同位置的NH₃、CO₂和空气颗粒物浓度。【结果】①舍内平均NH₃浓度为1.72 mg/m³,日变化差异显著(P＜0.05);阶段变化中,14日龄NH₃浓度显著高于21和35日龄(P＜0.05);纵向比较,7、14和28日龄中间和后端NH₃浓度显著高于前端(P＜0.05);垂直方向比较,21和35日龄由上至下NH₃浓度显著升高(P＜0.05),28日龄中层和下层等高位置NH₃浓度显著高于上层等高位置(P＜0.05);三维分布上,15个测量点间NH₃浓度存在显著性差异(P＜0.05),14日龄NH₃浓度差最大,为0.81 mg/m³。②舍内平均CO₂浓度为1 987 mg/m³。阶段变化中,14日龄CO₂浓度显著高于其他日龄(P＜0.05);日变化中,06:00和09:00 CO₂浓度高于15:00和18:00(P＜0.05),12:00最低;纵向比较,7日龄后端CO₂浓度显著高于前端和中间(P＜0.05),14日龄中间和后端CO₂浓度显著高于前端(P＜0.05),35日龄后端CO₂浓度显著高于前端(P＜0.05);垂直方向CO₂浓度差异均不显著(P＞0.05);三维分布上,15个测量点间CO₂浓度存在显著性差异(P＜0.05),35日龄CO₂浓度差最大,为471 mg/m³。③舍内细颗粒物(PM_2.5)、可吸入颗粒物(PM₁₀)和总悬浮颗粒物(TSP)平均浓度分别为125.28 μg/m³、155.24 μg/m³和2.17 mg/m³,日变化皆存在显著性差异(P＜0.05),阶段变化随日龄的增加显著升高(P＜0.05),纵向、垂直方向和三维分布差异均不显著(P＞0.05)。【结论】冬季叠层笼养肉鸡舍NH₃、CO₂和空气颗粒物浓度分布不均匀,CO₂浓度超标,需加强通风。