【目的】 测定麝鼠超长链脂肪酸延伸酶1(elongase of verylong chain fatty acid 1,Elovl1)基因序列并进行生物信息学分析,探讨其在麝鼠香腺发育和泌香过程中的作用。【方法】 使用TRIzol法提取成年雄性麝鼠香腺总RNA,采用转录组测序技术获得麝鼠香腺Elovl1基因序列并测序;在GenBank数据库中下载啮齿目不同物种的Elovl1基因及其多转录本CDS序列并构建系统进化树;通过在线工具对Elovl1基因编码蛋白的理化性质及结构进行预测与分析;利用实时荧光定量PCR技术分析成年雄性麝鼠香腺发育周期内香腺组织中Elovl1基因的表达水平。【结果】 Elovl1基因在麝鼠香腺中表达2个转录本,能编码2个不同的蛋白,分别由313和279个氨基酸组成。Elovl1基因2个转录本在2~9月末的麝鼠香腺中均有表达,且表达量整体呈先上升后下降的趋势。Elovl1基因编码的2个蛋白均为稳定的亲脂性、非分泌蛋白,具有7个跨膜螺旋区,亚细胞定位均主要位于内质网。在啮齿目动物中,Elovl1基因进化与物种进化基本一致,仓鼠科与鼠科亲缘关系较近,麝鼠与水鼠平亲缘关系最近;同一物种Elovl1基因的不同转录本间相对保守,均按物种聚在一起且置信值普遍较高,旱獭例外。【结论】 Elovl1基因表达规律与麝鼠香腺的发育、萎缩及泌香周期相吻合,提示Elovl1与麝鼠香分泌相关,并参与了香腺细胞发育。

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。

【目的】研究马身猪、晋汾白猪和杜长大猪骨骼肌肌纤维类型和能量代谢相关基因的表达特性。【方法】选取6月龄马身猪、晋汾白猪和杜长大猪,屠宰后采集背最长肌和趾长伸肌,采用HE染色检测肌纤维的直径、密度和横截面积,通过实时荧光定量PCR分别检测Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型和Ⅱx型肌纤维的标记基因(MYH7、MYH2、MYH4和MYH1),线粒体活性相关基因(ATP5A1、PGC1-α和PPARβ),电子传递链活性相关基因(UQCRC2、SDHA、NDUFA9),以及糖酵解活性相关基因(LDHA、LDHB和GK)的表达量。【结果】马身猪背最长肌肌纤维直径和横截面积均显著低于晋汾白猪和杜长大猪,而密度显著高于晋汾白猪和杜长大猪(P<0.05);马身猪和晋汾白猪趾长伸肌肌纤维直径和横截面积均显著低于杜长大猪,而密度显著高于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌MYH7基因的表达量最高,晋汾白猪最低;马身猪和晋汾白猪趾长伸肌MYH7基因的表达量显著高于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌和趾长伸肌MYH2基因的表达量显著高于晋汾白猪和杜长大猪,晋汾白猪趾长伸肌MYH2基因的表达量显著高于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌MYH4基因的表达量显著低于晋汾白猪和杜长大猪,马身猪和晋汾白猪趾长伸肌MYH4基因的表达量显著低于杜长大猪(P<0.05)。马身猪背最长肌中ATP5A1和PGC1-α基因的表达量均显著低于晋汾白猪和杜长大猪,晋汾白猪PGC1-α和PPARβ基因的表达量均显著低于杜长大猪(P<0.05);马身猪和晋汾白猪趾长伸肌中ATP5A1、PGC1-α和PPARβ基因的表达量均显著低于杜长大猪(P<0.05)。晋汾白猪背最长肌中UQCRC2、SDHA和NDUFA9基因的表达量均显著低于杜长大猪和马身猪(P<0.05);晋汾白猪和马身猪趾长伸肌中UQCRC2、SDHA和NDUFA9基因的表达量均显著低于杜长大猪,马身猪UQCRC2和SDHA基因的表达量均显著低于晋汾白猪(P<0.05)。晋汾白猪和马身猪背最长肌和趾长伸肌中LDHA、LDHB和GK基因的表达量均显著低于杜长大猪(P<0.05)。【结论】马身猪骨骼肌肌纤维直径和横截面积都较小,Ⅰ型和Ⅱa型肌纤维标记基因的表达量较高;杜长大猪骨骼肌Ⅱb型肌纤维标记基因的表达量较高,氧化磷酸化和糖酵解相关基因的表达量均较高。

【目的】 扩增牛妊娠相关蛋白19(bovine pregnancy-associated glycoprotein 19,BoPAG19)基因,构建真核表达载体,并检测其在HEK-293F细胞中的表达。【方法】 根据BoPAG19基因序列(GenBank登录号:NM_176628)体外合成BoPAG19基因,PCR扩增目的基因,经双酶切后与真核表达载体pcMV3连接,构建pcMV3-BoPAG19重组质粒。采用Lipofectamine^®2000将重组质粒瞬时转染至HEK-293F细胞,SDS-PAGE法鉴定细胞培养上清中BoPAG19蛋白的表达,采用亲和层析法纯化BoPAG19蛋白。通过在线工具分析BoPAG19蛋白的疏水性、跨膜区域、信号肽、B细胞抗原、二级结构、三级结构和蛋白相互作用。【结果】 成功构建pcMV3-BoPAG19重组载体,目的基因长约1 200 bp,表达蛋白约60 ku。生物信息学分析显示,BoPAG19蛋白编码380个氨基酸,其中含量最高的是丝氨酸(Ser),占比9.2%,含量最低的是色氨酸(Trp),占比1.6%;分子式为C₁₉₃₇H₃₀₂₈N₅₂₄O₅₃₂S₁₅,理论分子质量为41.8 ku,等电点为9.62,不稳定指数为40.75,在水中不稳定,脂肪系数为91.53,消光系数为52 370 mol^-1·cm^-1,具有水溶性;含有1个信号肽,无跨膜区域,有6个糖基化位点和11个B细胞表位;二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链占比分别为18.95%、6.32%、42.37%和32.37%,三级结构预测结果与二级结构一致。与BoPAG19互作的蛋白包括APLP2和APP,可能参与了妊娠期的神经调节。【结论】 试验成功表达、纯化了BoPAG19蛋白,并分析了BoPAG19的生物信息学特征,为BoPAG19蛋白的结构和功能研究,以及BoPAG19诊断奠定基础。

【目的】 探究CC趋化因子受体7(CC chemokine receptor 7,CCR7)基因编码蛋白的生物学特性及其mRNA在健康和炎性奶牛乳腺组织中的表达量。【方法】 使用PCR扩增并克隆中国荷斯坦奶牛CCR7基因CDS区,测序后进行相似性比对及系统进化树构建;使用多种生物信息学软件分析CCR7蛋白的组成、理化性质及结构等;使用实时荧光定量PCR技术检测CCR7基因在健康和炎性奶牛乳腺组织中的表达差异。【结果】 中国荷斯坦奶牛CCR7基因CDS区全长1 325 bp,与绵羊的相似性较高(95.2%),亲缘关系较近;与鸡的相似性较低(56.4%),亲缘关系较远。CCR7基因编码379个氨基酸,其中亮氨酸含量最多,缬氨酸含量次之,组氨酸和色氨酸含量最低;CCR7蛋白分子质量为14.56 ku,理论等电点为8.89,平均亲水系数为0.640,是一种跨膜疏水性蛋白。CCR7蛋白信号肽切割位点可能存在于第24和25位氨基酸之间。CCR7蛋白二级结构中α-螺旋占比最大,高达51.72%,三级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。CCR7基因在炎性奶牛乳腺组织中的表达量极显著高于健康乳腺组织(P<0.01),其可能在奶牛乳腺炎的免疫调控中有着重要的作用。【结论】 试验成功克隆出牛CCR7基因CDS区序列,并进行了相应的生物信息学分析及组织定量表达,为进一步研究CCR7基因的具体功能提供材料,对于探究CCR7基因在奶牛乳腺炎中的调控功能具有重要的意义。

【目的】 通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的慢病毒系统,构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】 根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号:NZ_CP081489.1)设计引物,并采用PCR扩增T7 RNAP基因片段,将其克隆至慢病毒载体中,构建pCDH-CMV-T7 RNAP重组质粒。筛选阳性克隆及测序鉴定后,利用脂质体将包含重组质粒pCDH-CMV-T7 RNAP的包装系统和辅助包装质粒共转染至HEK-293T细胞,进行慢病毒的包装及纯化,获得高病毒滴度的重组慢病毒。将收集的病毒液分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1、5、10和20感染BHK-21细胞,72 h后观察荧光情况,筛选最佳MOI。将重组慢病毒在最佳MOI条件下感染BHK-21细胞,通过绿色荧光蛋白copGFP的表达观察感染细胞的阳性率。使用4 μg/mL嘌呤霉素作为抗性筛选物进行多轮筛选,最终筛选得到BHK-21-T7 RNAP细胞株。进一步对所筛选的细胞株设计3对检测引物进行RT-PCR检测,并通过检测试验组与空白对照组细胞中海肾荧光素酶(hRluc)报告基因的活性差异来反映T7 RNAP驱动T7启动子下游基因的能力。【结果】 本研究成功扩增了大肠杆菌BL21(DE3)细胞基因组中T7 RNAP基因,成功构建重组慢病毒载体,并获得了滴度为1.0×10⁸ TU/mL的重组慢病毒。成功筛选到BHK-21-T7 RNAP细胞株,此重组细胞株经RT-PCR扩增能够检测到T7 RNAP的特异性DNA序列。将含有T7启动子驱动的hRluc的质粒(pT7-hRluc)转染此细胞株后发现,BHK-21-T7 RNAP细胞株中hRluc的活力与空白对照组BHK-21细胞相比极显著升高(P<0.01)。【结论】 本研究获得了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株,且所筛选的BHK-21-T7 RNAP细胞株中的T7 RNAP能够驱动pT7启动子下游基因hRluc的转录,研究结果为RNA病毒的反向遗传学平台建立奠定了细胞基础。

【目的】 通过对苏禽3号肉鸡的miR-10b-5p进行靶基因预测、生物信息学分析及其在鸡不同生长时期组织表达变化规律研究,探索其在鸡肌肉生长发育中作用。【方法】 通过文献和miRBase检索脊椎动物的miR-10b-5p序列,利用Ensembl数据库查询并确定miR-10b-5p在基因组中的位置,根据前体序列构建系统进化树;使用miRDB、microT和TargetScan网站预测miR-10b-5p靶基因,并对靶基因进行GO功能和KEGG通路分析,进而揭示miR-10b-5p的基因功能。采用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期鸡miR-10b-5p组织表达量,探索其在大脑、小脑、垂体、下丘脑、胸肌、腿肌、卵巢、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中表达变化。【结果】 miRBase检索共获得59种动物59条miR-10b-5p序列,即每一种动物都只有一种miR-10b-5p形式。基因定位分析发现,鸡miR-10b-5p位于2号染色体上的HOX基因家族中。常见物种miR-10b-5p成熟序列比对分析结果表明,miR-10b-5p的成熟序列相似性较高,物种间较为保守。系统进化树分析发现,miR-10b在哺乳类中的灵长目、啮齿目、鸟类、鱼类中各自先聚为一支,然后再共同聚为一类,这表明miR-10b在进化过程中是保守的。靶基因预测发现,miR-10b-5p共有300个靶基因。GO功能分析发现,靶基因主要富集到染色质组装和基因表达的转录后调控、组蛋白甲基转移酶复合物、转录因子复合物等功能。KEGG通路分析表明,靶基因主要富集到Wnt和p53信号通路上。组织表达分析显示,miR-10b-5p在检测的各个组织中均有表达;3日龄时大脑、小脑、垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量显著高于心脏、下丘脑、肾脏和肺脏等组织(P<0.05);90日龄时,垂体、胸肌、腿肌和大脑中miR-10b-5p表达量显著高于其他组织(P<0.05)。与3日龄雏鸡相比,90日龄时垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量均显著上升(P<0.05)。【结论】 鸡miR-10b-5p是组织广泛表达的miRNA,miR-10b在进化过程中是保守的,其可能通过Wnt及p53信号通路调控肌肉细胞增殖分化,进而调控鸡肌肉生长发育。

【目的】 研究miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响及其在不同组织中的表达情况,为探究miRNA在肌肉发育中的调控机制提供理论基础。【方法】 利用生物信息学方法预测miR-495-3p的靶基因;实时荧光定量PCR检测miR-495-3p及其靶基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌等组织中的表达水平。构建miR-495-3p的过表达(miR-495-3p mimic、miR-495-3p mimic NC)及抑制物(miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC),在山羊骨骼肌细胞汇合度达60%~70%时进行转染,并用含2%马血清的培养基进行诱导分化,用CCK-8检测细胞增殖活力,实时荧光定量PCR检测过表达和干扰效率及增殖分化相关基因配对盒基因(paired-box 7,Pax7)、细胞蛋白周期E(Cyclin E)、肌细胞生成素(myogenin,myoG)、生肌因子5(recombinant myogenic factor 5,Myf5)的表达;构建miR-495-3p靶基因的野生型和突变型载体并转染至293T细胞,用双荧光素酶测定miR-495-3p与其靶基因的结合情况。【结果】 生物信息学预测结果表明,miR-495-3p的靶基因为心肌肌动蛋白α1(alpha cardiacactin 1,ACTC1),且miR-495-3p和ACTC1在1和10月龄山羊背最长肌中表达量均差异极显著(P<0.01)。miR-495-3p和ACTC1在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌6种组织中均有表达,在背最长肌中表达量较高。细胞转染结果表明,miR-495-3p mimic极显著促进miR-495-3p的表达(P<0.01),miR-495-3p inhibitor极显著抑制miR-495-3p的表达(P<0.01),说明miR-495-3p mimic和miR-495-3p inhibitor可用于后续试验。实时荧光定量PCR结果表明,过表达miR-495-3p促进骨骼肌细胞分化相关标志基因MyoG、Myf5的表达,抑制miR-495-3p则降低MyoG、Myf5基因的表达;过表达、干扰miR-495-3p对Pax7、Cyclin E基因的表达及细胞增殖活力均无显著影响(P>0.05)。双荧光素酶报告结果表明,miR-495-3p与ACTC1基因存在靶向关系。【结论】 miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞的增殖无显著影响,但可通过靶向ACTC1基因促进山羊骨骼肌细胞分化。

【目的】 研究茶多酚对小鼠黑色素瘤细胞B16F10增殖和迁移的影响,以期为将茶多酚用于肿瘤的治疗提供依据。【方法】 用不同浓度茶多酚(0.05、0.10和0.15 g/L)处理B16F10细胞,不处理(0 g/L)的作为对照组,采用CCK-8法检测各组细胞生长情况,计算生长抑制率;不同浓度茶多酚处理细胞24 h后,采用划痕试验评价细胞的迁移能力;通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测B16F10细胞中小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)和黑色素形成限速酶(tyrosinase,TYR)mRNA和蛋白的表达水平。【结果】 与对照组相比,0.05 g/L茶多酚对B16F10细胞增殖无明显抑制作用(P>0.05),0.10和0.15 g/L茶多酚对B16F10细胞的增殖能力有极显著的抑制作用(P<0.01),且浓度越高,抑制作用越强;0.05、0.10和0.15 g/L茶多酚对B16F10细胞的迁移均有极显著的抑制作用(P<0.01);实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,随着茶多酚浓度的升高,MITF和TYR mRNA和蛋白的表达量均呈浓度依赖性降低,与对照组相比,0.05 g/L茶多酚显著降低MITF mRNA和蛋白的表达(P<0.05),0.10和0.15 g/L茶多酚均极显著降低MITF mRNA和蛋白的表达(P<0.01),0.10和0.15 g/L茶多酚均极显著降低TYR mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。【结论】 0.10和0.15 g/L茶多酚对B16F10细胞的增殖和迁移均有明显的抑制作用,并且能降低黑色素生成基因MITF和TYR的表达,表明茶多酚能抑制黑色素瘤的进展。

Snail家族基因编码具有锌指结构的转录因子,通过结合下游基因参与了多个生理水平的调控,在上皮-间质转化、胚胎发育、免疫调节、癌细胞迁移等方面具有广泛的生物学功能。Snail家族基因参与了脂肪的生成和脂代谢过程,同时也是肌生成决定因子(MyoD)的下游靶基因,也可能参与了肌肉发育调控。因此,Snail家族基因在脂肪生成、肌肉发育及脂代谢等方面发挥了重要作用,是影响哺乳动物特别是农业动物产肉性能和肉品质的一类重要候选功能基因。作者介绍了Snail家族基因及其蛋白结构和基本生物学功能,简述了Snail家族参与Wnt/β-catenin、Notch 等信号通路的调控作用方式,总结了Snail家族基因在哺乳动物脂肪生成和肌肉发育中的作用和调控方式。然而,目前关于Snail家族基因在协同参与哺乳动物脂肪生成和肌肉发育中扮演的角色仍待深入研究。另一方面,一般认为发挥转录抑制作用的Snail家族近年来也被发现具有转录激活作用,这种作用是如何实现的仍未知。因此,Snail家族基因在调控动物脂肪生成和肌肉发育过程中的协同作用、脂肪生成和脂肪水解过程的动态调控及其转录激活作用的发挥是今后研究的方向,为解析Snail家族基因在肉质性状形成过程中的遗传调控机理奠定基础。

【目的】 研究卵巢肿瘤去泛素化酶7A(OTUD7A)基因与鹅肥肝形成的关系。【方法】 选取健康、体重一致的70日龄朗德鹅公鹅40只,随机分为2组,对照组自由采食,试验组进行填饲试验,其中填饲第1~5天每日采食量为500 g,第6~12天每日采食量为800 g,第13~19天每日采食量为1 200 g。在填饲第7、14和19天时,每组随机选取6只鹅屠宰,取肝脏,采用实时荧光定量PCR测定不同填饲阶段肝脏中OTUD7A基因的表达水平。采用Ⅳ型胶原酶消化法分离23胚龄的鹅原代肝细胞,分别用浓度为0(空白组)、125、250 mmol/L的葡萄糖,0(空白组)、50、100、200 nmol/L的胰岛素,0(空白组)、0.125、0.250 mmol/L的油酸、亚油酸及0(空白组)、0.25、0.50 mmol/L棕榈酸处理鹅原代肝细胞,并用实时荧光定量PCR检测这些脂肪肝形成相关因子对OTUD7A基因表达水平的影响。构建过表达OTUD7A基因的载体pcDNA3.1-OTUD7A,并将构建好的过表达重组质粒转染鹅原代肝细胞,通过转录组学测序(RNA-Seq)进行差异表达基因的筛选,并对获得的差异表达基因进行GO功能富集分析。【结果】 在填饲第7、14天时,鹅肝脏中的OTUD7A基因表达显著高于对照组(P<0.05)。与空白组相比,250 mmol/L葡萄糖处理以及0.125 mmol/L和0.250 mmol/L棕榈酸处理均显著提高鹅原代肝细胞中OTUD7A基因的表达水平(P<0.05)。转录组学测序结果表明,OTUD7A基因过表达后共筛选到34个差异表达基因,其中有19个基因表达上调、15个基因表达下调。GO功能富集分析发现,差异表达基因注释到对微生物的防御反应、对外界生物刺激的反应、T细胞分化、细胞外外泌体等条目,其中CLMP、PROCR、SH3BP1、ARHGAP28、ACE、OTUD7A、LOC106045877、LOC106048002基因的表达上调,TNFSF8、DDX60、PLAC8、RSAD2、MX1、RSAD2、GBP1基因的表达下调。【结论】 鹅肥肝形成过程中OTUD7A基因的表达水平升高,OTUD7A基因可能通过调控TNFSF8、RSAD2、MX1、GBP1、CLMP和PROCR等基因的表达参与鹅肥肝的形成。

【目的】 试验旨在研究饲喂水平对多胎萨福克公羊生长性能、屠宰性能、内脏等器官发育的影响。【方法】 采用单因素试验方法,选择体况健康、体重相近(20.00±1.50 kg)的多胎萨福克公羊18只,随机分成3组,每组6只,试验Ⅰ组自由采食,试验Ⅱ组饲喂自由采食量的60%,试验Ⅲ组饲喂自由采食量的40%。当试验Ⅰ组试验羊平均体重达到35 kg时,将所有试验羊屠宰,测定生长性能、屠宰性能及内脏器官重量和发育情况。预饲期7 d,正试期50 d。【结果】 ①随着饲喂水平降低,试验羊平均干物质采食量(ADMI)、终末体重、净增重、平均日增重(ADG)均显著降低(P<0.05);试验Ⅰ、Ⅱ组料重比(F/G)均显著低于试验Ⅲ组(P<0.05)。②试验Ⅰ组胴体重、胴体净肉重和脂肪重显著高于试验Ⅱ和Ⅲ组,各组间差异均显著(P<0.05);试验Ⅰ组净肉率显著高于其他2组(P<0.05);试验Ⅰ组骨重、肉骨比和腹脂重显著高于试验Ⅲ组(P<0.05);试验Ⅲ组腹脂率显著低于其他2组(P<0.05)。③试验Ⅰ组瘤胃重量最高,试验Ⅲ组最低,且各组之间差异显著(P<0.05);试验Ⅰ组网胃重量和肠道总重量最高,试验Ⅱ组次之,试验Ⅲ组最低,3组之间差异均显著(P<0.05)。④试验Ⅰ组心脏、肝脏、肺脏和肾脏重量最高,试验Ⅱ组次之,试验Ⅲ组最低,各组间差异均显著(P<0.05)。⑤试验Ⅰ组头蹄重量最高,显著高于试验Ⅲ组(P<0.05),与试验Ⅱ组差异不显著(P>0.05);试验Ⅰ组皮毛、血重量最高,试验Ⅱ组次之,试验Ⅲ组最低,3组之间差异均显著(P<0.05)。【结论】 不同饲喂水平可不同程度影响多胎萨福克公羊的生长性能、屠宰性能和主要生理器官发育。

【目的】 通过研究初生机会猪(体重<1.20 kg)灌服不同水平牛至精油和初乳复合物(EC)对其生长性能、血清抗氧化及免疫指标的影响,为促进机会猪健康发展提供技术依据。【方法】 选择128头体况相近、胎次相近(2/3胎)的大长二元母猪,随机分为4组,每组32头,所有母猪饲粮配方一致。对每组母猪所产仔猪中的机会猪在出生后分别灌服0 mL(对照组,CON)、2 mL(EC2组,1次灌服)、4 mL(EC4组,连续2 d灌服)和6 mL(EC6组,连续3 d灌服)牛至精油和初乳复合物。试验期从出生到断奶共21 d,试验期间记录所有仔猪的初生重和结束体重,用于计算机会猪的平均日增重(ADG),并在试验结束后采集机会猪血清用于测定抗氧化和免疫相关指标。【结果】 与对照组相比,初生机会猪灌服EC显著提高了断奶重和平均日增重(P<0.05),且各腹泻指标均显著降低(P<0.05);EC4和EC6组死亡率显著降低(P<0.05);EC4组各腹泻指标和死亡率均显著低于EC2组(P<0.05)。EC6组血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性均显著低于CON组(P<0.05),球蛋白(GLB)、免疫球蛋白A(IgA)、IgG、IgM水平及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均显著高于CON和EC2组(P<0.05)。【结论】 初生机会猪灌服EC可提高其生长性能,且连续灌服2 d可显著减少腹泻和死亡;连续灌服3 d可提高免疫性能和抗氧化性能。

【目的】 本试验旨在研究饲粮中添加复方中药发酵粉对断奶仔猪生长性能、养分表观消化率、抗氧化功能以及免疫功能的影响。【方法】 试验选取48头体重为(8.290±0.140)kg、健康状况良好的28日龄三元(杜×长×大)杂交去势断奶仔猪,按照体重随机分为2组,每组6个重复,每个重复4头猪。对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂基础饲粮+3%复方中药发酵粉,其中复方中药发酵粉由山楂、陈皮、鸡内金、山药、茯苓等原料发酵而成,其主要活性物质包括有机酸、黄酮类物质、多糖类及三萜类物质等。试验为期28 d,试验结束前3 d采集饲粮样和粪样,试验结束后每个重复选取1头接近平均体重的断奶仔猪进行屠宰,采集血浆和肝脏,测定生长性能、养分表观消化率、血浆和肝脏抗氧化指标、血浆免疫指标等。【结果】 与对照组相比,复方中药发酵粉组断奶仔猪平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)均无显著差异(P>0.05),但其平均日增重(ADG)显著提高(P<0.05),腹泻率显著降低(P<0.05);粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)和钙(Ca)的表观消化率均极显著或显著提高(P<0.01;P<0.05);血浆过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及总抗氧化能力(T-AOC)均显著或极显著提高(P<0.05;P<0.01),肝脏总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性显著提高(P<0.05);血浆免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)含量均显著提高(P<0.05),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量显著降低(P<0.05)。【结论】 在饲粮中添加3%复方中药发酵粉可提高断奶仔猪对粗脂肪、粗灰分和钙的表观消化率,提高断奶仔猪机体的抗氧化功能和免疫功能,从而降低断奶仔猪腹泻率,提高其生长性能。

【目的】 研究6月龄波尔山羊与麻城黑山羊的血液生理生化指标、胴体性状、肌纤维直径、肌内脂肪含量的差异情况,以期为2个品种山羊的饲养管理、引种改良及杂交利用提供参考依据。【方法】 分别选取8只3月龄±5 d、健康的波尔山羊与麻城黑山羊在统一条件下饲养3个月,饲养结束采集血液测定白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)等14项血液生理指标及肌酐(CRE)、总胆红素(TBIL)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、总蛋白(TP)等14项血液生化指标;测定体重、体高、体斜长、胴体重、屠宰率、眼肌面积等12项胴体性状;屠宰后取背最长肌肌肉组织,切片后经苏木素伊红和改良油红O染色,分别检测肌纤维直径和肌内脂肪含量。【结果】 血液生理指标中,波尔山羊的红细胞比容、平均红细胞体积均显著低于麻城黑山羊(P<0.05),平均红细胞血红蛋白浓度显著高于麻城黑山羊(P<0.05),其余指标均无显著性差异(P>0.05);血液生化指标中,波尔山羊的总蛋白、球蛋白、血磷含量与淀粉酶活性均极显著低于麻城黑山羊(P<0.01),钾离子含量极显著高于麻城黑山羊(P<0.01),其余指标均无显著性差异(P>0.05);胴体性状中,波尔山羊的体重、平均日增重、背最长肌重、股二头肌重和胴体重均显著高于麻城黑山羊(P<0.05),眼肌面积极显著大于麻城黑山羊(P<0.01),其余指标均无显著性差异(P>0.05);波尔山羊的肌纤维直径极显著大于麻城黑山羊(P<0.01),肌内脂肪含量显著高于麻城黑山羊(P<0.05)。【结论】 波尔山羊与麻城黑山羊血液指标、屠宰性能均存在较大的差异,结果可为研究波尔山羊与麻城黑山羊的种质特征提供理论依据。

【目的】 研究以发酵麸皮多糖、肉桂醛、丁香酚和辣椒油树脂为主的复合营养素对杜寒育肥羊生长性能、养分表观消化率及血清指标的影响,以期为复合营养素在肉羊生产中的应用提供一定的理论依据。【方法】 试验采用单因素完全随机试验设计,选择体重为(29.69±3.11)kg的36只2~3月龄杜寒杂交母羊,随机分为3组,每组6个重复,每个重复2只羊。对照组(CON)饲喂基础饲粮,试验Ⅰ和Ⅱ组分别饲喂添加2.5和5.0 g/kg复合营养素的试验饲粮。预试期14 d,正试期60 d。试验开始和结束当天晨饲前称重测定其生长性能指标,并采集血液样品测定血清生理生化、免疫与抗氧化能力等指标;在正试期第24~30和54~60天持续采集7 d粪样和饲料样,早晚各采集1次,用于测定营养物质表观消化率。【结果】 ①与对照组相比,试验Ⅰ组育肥羊的终末重和平均日增重均显著增加(P<0.05),料重比降低,但差异不显著(P>0.05),试验Ⅰ和Ⅱ组育肥羊干物质采食量均显著升高(P<0.05)。②与对照组相比,在第24~30天时,试验Ⅰ组育肥羊对干物质和有机物的表观消化率显著提高(P<0.05)。③饲粮中添加复合营养素对育肥羊血清生化各指标均无显著影响(P>0.05);与对照组相比,试验结束时,试验Ⅰ和Ⅱ组育肥羊血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)含量均显著升高(P<0.05),试验Ⅱ组育肥羊血清中谷胱甘肽(glutathione,GSH)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)含量均显著降低(P<0.05),试验Ⅰ组育肥羊血清中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量显著降低(P<0.05)。【结论】 饲粮中添加2.5 g/kg复合营养素能够增加育肥羊干物质采食量和表观消化率,并改善其免疫功能,提高机体抗氧化水平。

【目的】 探究陕西林麝群体的遗传多样性,了解林麝的遗传信息。【方法】 采集林麝毛发提取DNA,测定43只林麝个体的线粒体DNA(mtDNA)细胞色素b(cytochrome b,Cytb)基因和非编码序列置换环(D-loop)区序列,统计碱基组成,使用ClustalX 2.0软件对所有序列进行整合比对,以获得群体中的核苷酸多态位点(SNP);利用DNASP 5.10软件统计种群核苷酸多样性(Pi)、序列的单倍型数(H)、单倍型多样度(Hd)、平均核苷酸差异数(K)等参数;利用Mega 7.0软件计算Cytb基因和D-loop区序列不同单倍型间遗传距离,并构建Neighbor-Joining(NJ)系统进化树。【结果】 Cytb基因和D-loop区序列中AT含量均高于GC含量,显示碱基组成具有偏好性;在Cytb基因和D-loop区内分别发现241和383个SNPs位点。其中,Cytb基因和D-loop区核苷酸多样性分别为0.28343和0.07707,单倍型多样性分别为0.983和0.975,表明其群体遗传多样性丰富;Cytb基因35个单倍型之间的遗传距离为0.002~0.831,D-loop区29个单倍型之间的遗传距离为0.006~1.342。系统进化树结果显示,林麝存在2个线粒体支系,表明其具有2个线粒体母系来源;D-loop区的进化分析也支持这一结论。【结论】 林麝群体的核苷酸多样性和单倍型多样较高,遗传多样性较丰富,同时进一步支持了林麝和原麝属于一个分支的观点。

【目的】 分析肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因内含子Ⅱ的多态性及其对绵羊生长性状的影响,筛选对绵羊生长发育有显著影响的分子标记,以期为绵羊的分子育种提供参考。【方法】 选取大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊5种绵羊为研究对象,采用PCR-RFLP技术对MyoG基因内含子Ⅱ(Eco72 Ⅰ)进行基因分型,利用PopGene32软件计算绵羊MyoG基因内含子Ⅱ的群体遗传多样性,利用SPSS 17.0软件对不同基因型与绵羊生长性状进行关联分析。【结果】 小尾寒羊、杜泊羊、湖羊群体中MyoG基因内含子Ⅱ均存在3种基因型:AA(368/540 bp)、AB(908/368/540 bp)和BB(908 bp);大尾寒羊和豫西脂尾羊群体中仅检测到2种基因型:AB(908/368/540 bp)和BB(908 bp)。大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊的AB基因型频率分别为0.845、0.633、0.917、0.706和0.811,BB基因型频率分别为0.155、0.033、0.083、0.176和0.054,AA基因型频率分别为0、0.333、0、0.118和0.135。小尾寒羊的杂合度最低(0.455),杜泊羊的杂合度最高(0.497),表明杜泊羊的遗传多样性要高于其他群体;5个群体多态信息含量(PIC)均为中度多态(0.25<PIC<0.5)。关联分析发现,小尾寒羊MyoG基因内含子Ⅱ BB基因型个体胸围、胸宽、头长、颈长均显著低于AA、AB基因型(P<0.05)。【结论】 MyoG基因内含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位点可作为影响绵羊生长性状的分子标记,结果可为今后绵羊生长性状的分子标记辅助选择提供参考。

利用传统方法在畜禽特定基因座上进行基因组修饰时,只能通过在体细胞中进行同源重组再经细胞核移植实现。传统同源重组方法的困难性和低效性阻碍了基因修饰在畜禽遗传育种中的广泛应用。近年来,位点特异性核酸内切酶的发现为靶向基因修饰提供了一条更直接的途径,主要由于这些酶能直接在DNA序列上进行一步式的基因编辑。成簇规律间隔短回文重复序列/Cas关联蛋白9(clustered regularly interspersed short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9)是一种RNA导向的DNA内切酶,精准定位于特定的靶位点,高效完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas9技术作为精准而强大的第3代基因组编辑工具,已经成功应用于猪、牛、山羊、绵羊和鸡上,这些CRISPR/Cas9基因编辑畜禽可作为研究人或畜禽生理和病理的生物模型、生产功能性蛋白质的生物反应器或器官移植的供体。特别是在畜禽生产方面,CRISPR/Cas9基因编辑可用于改善生产遗传特性及畜产品质量,提高畜禽对疾病的抵抗力。作者对当前畜禽中特定位点基因组修饰的CRISPR/Cas9技术的原理及基因组编辑在畜禽育种中应用的最新进展进行了综述,以期为推进CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究提供参考。

【目的】 研究泛酰巯基乙胺酶-1(panthenoyl mercaptoethamine-1,VNN1)基因多态性与F3代波杂山羊产羔数的关系,从而从分子水平指导F3代波杂山羊的育种工作。【方法】 选取107只F3代波杂山羊,采集血样提取DNA,根据VNN1基因(登录号:NC_030816.1)外显子序列设计7对引物,进行PCR扩增及测序,运用DNAStar软件分析测序结果,对可能存在的单核苷酸多态性(SNP)位点外显子全群进行PCR扩增测序,并进行Hardy-Weinberg平衡状态及遗传多样性分析;应用SPSS 16.0统计学软件对VNN1基因不同基因型与F3代波杂山羊产羔数进行关联分析。【结果】 在VNN1基因在第5和7外显子中共发现7个SNPs位点:g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11284 C→A、g.11313 T→C、g.18094 C→T和g.18158 G→C,且每个位点均存在3种不同基因型。χ²检验显示,g.10956 A→G、g.11010 C→T、g.11103 C→T、g.11313 T→C和g.18094 C→T位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态,g.11284 C→A和g.18158 G→C位点均处于Hardy-Weinberg不平衡状态。多态信息含量均为中度多态((0.25<PIC<0.5)。关联分析发现,g.11010 C→T和g.11313 T→C位点与F3代波杂山羊产羔数显著相关,其中g.11010 C→T位点CC基因型产羔数显著低于CT和TT基因型,g.11313 T→C位点TT基因型产羔数显著低于TC和CC基因型(P<0.05);g.10956 A→G、g.11103 C→T和g.18158 G→C位点对F3代波杂山羊产羔数均无显著影响(P>0.05)。【结论】 VNN1基因在第5和7外显子中共发现7个SNPs位点,其中g.11010 C→T和g.11313 T→C位点对F3代波杂山羊产羔数有显著影响,VNN1基因可作为F3代波杂山羊的候选基因。

【目的】 在分子水平上探讨大围山微型鸡的遗传进化。【方法】 以大围山微型鸡与其他18个地方鸡品种及2个国外引进品种为研究对象,每个品种选取公鸡10只,母鸡20只,采血,提取全基因组DNA,进行简化基因组测序(RAD-Seq),鉴定21个品种基因组SNP,计算大围山微型鸡遗传统计量,分析遗传多样性和遗传结构、筛选受选择基因并进行功能富集分析。【结果】 在大围山微型鸡群体中鉴定出331 892个SNPs。大围山微型鸡的平均杂合度(Ho)为0.219、核苷酸多样度(Pi)为0.245,近交系数(Fis)为0.107,与其他18个地方鸡种相比遗传多样性呈中度多态。聚类分析发现,大围山微型鸡与瓢鸡、茶花鸡和藏鸡聚为一类,亲缘关系较近,且与瓢鸡的群体分化指数(Fst)最低(0.0929),亲缘关系最近,与河南斗鸡的Fst最高(0.2179),亲缘关系最远。共筛选出200个受选择基因。GO分析结果显示,这些受选择基因主要富集在运动、刺激应答、信号传导等生物学过程;KEGG分析结果表明,这些受选择基因主要富集在代谢、肌动蛋白细胞骨架的调节、MAPK等信号通路。【结论】 大围山微型鸡遗传多样性呈中度多态,与瓢鸡亲缘关系最近,本研究筛选出了200个受到选择的基因,这些基因在代谢、信号传导、颅骨发育等多个方面发挥作用。

【目的】 克隆多浪羊C型利钠肽(CNP)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在多浪羊初情期启动前后下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中的表达规律,以期为研究CNP基因在多浪羊初情期启动过程中的作用机制提供参考。【方法】 参考GeneBank中绵羊CNP基因的序列(登录号:XM_027974523.1)设计引物,以初情期前、初情期、初情期后的多浪羊为试验对象,采用RT-PCR技术扩增多浪羊CNP基因并进行克隆测序;用DNAMAN软件同其他物种进行相似性比对,并使用Mega 5.0构建系统发育树。用生物信息学软件分析CNP基因的核苷酸序列及其编码蛋白的疏水性、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域等理化性质和二级结构、三级结构信息;用实时荧光定量PCR技术检测多浪羊下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中CNP基因的表达量。【结果】 多浪羊CNP基因序列大小为2 227 bp,其中包括5'-UTR 50 bp、3'-UTR 914 bp和CDS区1 263 bp。相似性比对和系统发育树结果显示,多浪羊与山羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;多浪羊CNP基因共编码420个氨基酸,其编码蛋白是亲水性蛋白质,无跨膜结构域和信号肽。多浪羊CNP蛋白的二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲;三级结构预测显示CNP蛋白无配体结构;实时荧光定量PCR结果显示,在初情期启动的3个发育阶段,下丘脑中CNP基因表达量显著高于其他组织(P<0.05);初情期下丘脑中CNP基因的表达量显著低于初情期前(P<0.05);子宫中初情期前CNP基因的表达量显著高于初情期和初情期后(P<0.05)。【结论】 本研究成功克隆了多浪羊CNP基因,其主要在下丘脑和子宫中表达;在初情期前、初情期、初情期后的发育过程中,下丘脑组织中CNP基因的表达量先降低再升高,提示CNP基因可能在初情期的启动过程中参与调控。

【目的】 筛选出塔河马鹿高质量的单核苷酸多态性位点(SNP),构建特异性分子遗传标记,为塔河马鹿的纯种鉴别提供参考。【方法】 对国家特种经济动物资源共享平台1999年收集整理的32份塔河马鹿血液DNA样本进行全基因组重测序,与梅花鹿染色体级别的参考基因组进行比对,统计比对率、覆盖度和测序深度。用SNPEff统计每条染色体上SNP位点的分布,用SNPhylo基于位点构建分子进化树,用VCFTOOLS计算遗传分化指数(Fst),按降序排序并设定阈值Fst≥0.25,淘汰不符合条件位点,用R语言进行主成分分析(PCA),统计33条染色体排名前1 500的SNPs位点,提取前100个SNPs集合的特征值,分别进行主成分分析。【结果】 全基因组重测序结果表明,32份质检合格的塔河马鹿血液基因组DNA有效数据量为868 791 354 600 bp,测序质量均符合后续数据分析要求。32份样品测序数据的平均比对率为98.06%,平均覆盖度为97.66%,平均深度为6.787。过滤后得到20 139 122个高质量的SNPs位点,其中4号染色体上SNPs分布最多,90%以上的变异位于基因间和外显子区域。建树后候选特异性SNPs位点数为12 050 781个。使用VCFTOOLS筛选得到544 717个SNPs位点。选取每条染色体排名前1 500的SNPs位点进行主成分分析,主成分分析结果显示,当SNPs从49 500降至100时区分效力没有下降,最终筛选出100个特异性强、稳定性高的塔河马鹿SNPs位点。【结论】 通过全基因组重测序技术和生物信息学分析得到了100个塔河马鹿特异性SNPs位点,为塔河马鹿的纯种鉴别以及核心种质的筛选工作提供了理论依据。

多不饱和脂肪酸(PUFA)主要分为ω-3 PUFA和ω-6 PUFA,是精子质膜脂质的主要成分,对精子抗氧化、提高精子质膜流动性、维持精子结构完整性及睾酮合成等具有重要作用。不同类型PUFA对精液品质的作用有所不同,ω-6 PUFA中的花生四烯酸(AA)能够促进睾酮的分泌,但精浆中过量的AA可能诱导氧化应激;亚油酸(LA)同样可提高体内睾酮水平,共轭亚油酸(CLA)可降低精子的氧化应激;动物体内少量的二十二碳五烯酸(DPA)不仅能参与精子的运输过程,还能提高精子的抗氧化能力。ω-3 PUFA中的α-亚麻酸(ALA)具有抗氧化作用并能刺激睾酮的合成,二十二碳六烯酸(DHA)作用与ALA相似,可提高精子的抗氧化能力,同时可促进睾酮合成;二十碳五烯酸(EPA)对精子结构及睾酮合成具有调节作用。适当的ω-6/ω-3 PUFA比例对精子的活力、质膜结构、脂质组成和顶体反应均具有重要的调节作用。PUFA对精子的作用可因添加的方式、类型、ω-6/ω-3PUFA的比例及动物种类的不同而有所不同。近年来,PUFA对动物精液品质作用的相关研究取得了较大进展,但其提高精液品质的作用机制仍需进一步深入探讨。作者综述了在饲粮或精液稀释液中添加不同类型的ω-3 PUFA、ω-6 PUFA及ω-6/ω-3 PUFA比例对精子的影响,以期为深入了解PUFA在动物精液生产中的应用提供理论参考。

【目的】 探求一种无损的、非侵入性的、快速的胚胎性别鉴定方法。【方法】 以207个猪卵胞质内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)胚胎及其培养液为研究对象,单个胚胎经巢式PCR扩增鉴定其性别后随机分成训练集和测试集,同时利用拉曼光谱技术获取单个ICSI胚胎培养液的拉曼光谱。原始光谱经过处理后,采用支持向量机(support vector machine,SVM)算法构建分类模型,先用训练样本进行训练和建模,然后预测测试样本的性别,结合PCR性别鉴定的结果,计算分类准确率。【结果】 通过巢式PCR对207个胚胎进行性别鉴定,鉴定出71个雄性胚胎、128个雌性胚胎,8个样品扩增失败。猪ICSI雄性胚胎培养液在1 082和1 360 cm^-1拉曼位移处特征峰强度明显高于雌性胚胎,构建的胚胎性别鉴定模型的分类准确率为81.5%,雌性和雄性胚胎的分类准确率分别为81.3%和81.8%。【结论】 本研究将拉曼光谱技术与SVM法相结合构建了胚胎性别鉴定模型,分类准确率达到81.5%,提供了一种新的、无损的胚胎性别鉴定方法。

【目的】 分析布鲁氏菌分泌蛋白BPE005的蛋白结构及细胞定位,筛选宿主细胞内与其存在相互作用的靶蛋白,为后续研究BPE005的生物学功能奠定基础。【方法】 通过生物信息学软件对BPE0005的蛋白结构进行初步分析;构建PDRRED2-C1-BPE005重组荧光定位载体,转染人胚肾上皮细胞293T,通过扫描激光共聚焦显微镜观察BPE005的细胞定位;构建PGBKT7-BPE005诱饵载体,验证诱饵载体是否有细胞毒性和自激活现象;以小鼠巨噬细胞RAW264.7 mRNA的cDNA文库为AD文库菌液,检测文库滴度,通过酵母双杂交系统筛选宿主细胞内与BPE005相互作用的靶蛋白。【结果】 布鲁氏菌分泌蛋白BPE005属于疏水性蛋白,内含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链。成功构建PDRRED2-C1-BPE005荧光定位载体和PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体,BPE005定位于宿主细胞核。PGBKT7-BPE005诱饵蛋白载体无酵母细胞毒性和自激活现象,AD文库菌液滴度>2×10⁷/mL,筛选出4个宿主细胞内与BPE0005存在相互作用的蛋白:RNA聚合酶Ⅱ多肽G、补体因子H、鸟苷酸环化酶2G及颗粒蛋白。经复筛、测序、BLAST比对、一对一验证后,最终筛选出1个在宿主细胞内与BPE005具有较强相互作用的靶蛋白(RNA聚合酶Ⅱ多肽G)。对该蛋白的作用网络分析表明,RNA聚合酶Ⅱ多肽G对宿主细胞内mRNA的转录和合成具有重大影响。【结论】 布鲁氏菌分泌蛋白BPE005定位于宿主细胞核,在宿主细胞内可与RNA聚合酶Ⅱ多肽G产生较强相互作用,对进一步阐明布鲁氏菌感染过程中关键效应分子的作用机制具有指导意义。

【目的】 研究H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)对哺乳动物的传染性和致病性。【方法】 采集样品进行病毒的分离鉴定,将分离到的病毒以300 μL/只(10⁷ EID₅₀)的剂量通过滴鼻和肺递送方式感染豚鼠,每组各15只,对2组感染效果进行比较,然后通过分离株在豚鼠中的传播能力试验验证其气溶胶传播能力,通过间接免疫荧光试验检测分离株在人支气管上皮细胞上的复制能力。【结果】 试验分离到1株H9N2亚型AIV,命名为SD18,病毒通过肺递送和滴鼻2种攻毒方式感染豚鼠后,肺递送组的排毒量显著高于滴鼻组(P<0.05)。通过对豚鼠肺脏相关模式识别受体和抗病毒蛋白的表达检测发现,2种攻毒方式都能诱导相关的免疫因子Toll样受体3(TLR3)、TLR7、抗黏病毒蛋白(MX)和2',5'-腺苷酸激酶(OAS)表达量极显著上调(P<0.01);2组在攻毒后第6天产生抗体,并呈上升趋势。对SD18 株在豚鼠中的传播能力验证发现,SD18株具有通过直接接触和飞沫传播感染豚鼠的能力,但并未证实气溶胶的产生和传播。对SD18株感染人支气管上皮细胞BEAS-2B后发现,在感染后12 h可检测到病毒,24 h时病毒在细胞内复制能力最强,TLR3、TLR7、MX、OAS、白介素6(IL-6)、IL-8、干扰素-β(IFN-β)相关的免疫因子表达量极显著上调(P<0.01)。【结论】 H9N2亚型AIV SD18株的跨种传播能力变强,具有不经提前适应便可直接感染豚鼠的能力;SD18株具有通过飞沫传播感染豚鼠并使其产生抗体的能力且SD18株可在人支气管上皮细胞BEAS-2B上进行复制。

【目的】 研究种鸽感染毛滴虫对乳鸽的危害,为鸽场毛滴虫病的防治提供参考。【方法】 分别选择18对未感染和18对感染毛滴虫的种鸽为对照组和试验组,每对种鸽哺育2只乳鸽,试验期28 d,统计乳鸽的死亡率、生长性能和胴体性能,以及免疫器官指数和抗体水平等生化指标。【结果】 试验组乳鸽的口腔毛滴虫数量显著高于对照组(P<0.05),且虫株数量随乳鸽日龄增长而增长;试验组乳鸽死亡率为26.92%,显著高于对照组(P<0.05);试验组乳鸽1~7日龄的平均日增重显著低于对照组(P<0.05),但出栏重和胴体性能无显著差异(P>0.05);毛滴虫可造成口腔黏膜、胸腺、肝脏和脾脏等组织出现明显病理损伤,血液中白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性显著升高(P<0.05),可溶性抗原CD8(sCD8)水平显著降低(P<0.05)。【结论】 综上,种鸽感染毛滴虫后可通过哺喂鸽乳的过程导致乳鸽感染,引起乳鸽肝脏和脾脏等组织出现明显病理损伤,免疫功能下降,死亡率升高。

【目的】 制备一种适用于治疗由金黄色葡萄球菌小菌落变异株(Staphylococcus aureus small colony variants,SASCVs)引起奶牛乳腺炎感染的槲皮素-替米考星混合物纳米粒,评价其对SASCVs菌株的抗菌活性。【方法】 通过对槲皮素(0.05、0.10、0.15和0.20 g)和替米考星原料药用量(0.2、0.3、0.4和0.5 g)及转速(500、1 000、1 500 r/min)、反应时间(0.5、1.0、2.0 h)、反应温度(25、50、75 ℃)、溶剂浓度(5.0%、7.5%、10.0%)进行考察,以外观性状为指标,筛选槲皮素-替米考星混合物纳米粒最优配方和制备条件;以微观形态、沉降体积比、再分散性、粒径和Zeta电位为指标,对制备的槲皮素-替米考星混合物纳米粒表征;通过琼脂扩散法、微量肉汤稀释法和体外杀菌曲线,对比槲皮素-替米考星混合物纳米粒和市售替米考星溶液对SASCVs菌株的抗菌活性,评价槲皮素-替米考星混合物纳米粒的优势。【结果】 当替米考星为0.4 g、槲皮素为0.1 g、溶剂为20 mL 7.5%的聚乙二醇溶液,在转速为1 000 r/min、反应时间为1 h、反应温度为50 ℃时,所制备的槲皮素-替米考星混合物纳米粒最优,其溶液外观性状显示颜色清亮,无沉淀和絮状物;微观形态显示该混合物纳米粒分布均匀,颗粒大小一致;沉降体积比为1,再分散性良好,平均粒径为741.9 nm,Zeta电位为-7.69 mV。替米考星标准品、槲皮素-替米考星混合物纳米粒和市售替米考星溶液对SASCVs菌株的抑菌圈直径分别为2.54、1.51和1.38 cm,对SASCVs菌株的最低抑菌浓度分别为1、1和2 μg/mL;体外杀菌曲线表明,槲皮素-替米考星混合物纳米粒对SASCVs菌株表现出明显的浓度依赖性。【结论】 本研究所制备的槲皮素-替米考星混合物纳米粒对SASCVs菌株具有较强杀菌能力,可为治疗由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供基础研究资料。

【目的】 探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)截短M蛋白的序列结构特征与原核表达情况。【方法】 根据已公布的PEDV M基因序列设计1对特异性引物,以从阳性病料提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增并克隆PEDV截短的M基因(rM),应用在线生物信息学软件预测rM蛋白的结构特征。将得到的截短的M基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET-28a-rM,将鉴定正确的pET-28a-rM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功构建重组菌株BL21(pET-28a-rM),并对重组菌株进行IPTG诱导表达,优化重组蛋白的表达条件,重组蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE及Western blotting检测,同时应用重组蛋白制备兔抗rM多克隆抗体。【结果】 试验克隆得到大小为366 bp的截短的M基因,重组蛋白由121个氨基酸组成,预测蛋白分子质量大小约为12.8 ku。该蛋白的二级结构由无规则卷曲、延伸链、β-转角和α-螺旋组成,占比分别为48.76%、33.88%、9.09%和8.26%。该蛋白不含信号肽,但有跨膜区,包含21个磷酸化位点。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白大小约为15 ku,以包涵体蛋白形式存在,在37 ℃、1 mmol/L IPTG诱导12 h时蛋白的表达量最高。Western blotting检测结果表明,重组蛋白与PEDV阳性血清具有较好的反应原性,纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得的高免血清效价高于1∶51 200。【结论】 本研究成功克隆PEDV 截短的M基因,对rM蛋白进行了生物信息学分析,获得了高纯度的rM蛋白,为猪流行性腹泻治疗及检测用生物制品的开发奠定了基础。

【目的】 探究禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)感染禽类后导致免疫器官发生细胞凋亡的机理。【方法】 以1日龄SPF雏鸡为试验对象,将100只SPF雏鸡随机均分为REV感染组和未感染病毒的对照组,REV感染组雏鸡经腹腔感染500 μL REV稀释液,对照组雏鸡经相同途径注射等量灭菌生理盐水,于病毒感染后第1、7、14、21、28和42天,2组雏鸡随机各抽取5只,心脏采血处死雏鸡后快速摘取法氏囊。分别应用HE染色和病理切片成像系统测定分析法氏囊细胞核浆比,TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒测定凋亡细胞数,免疫组化法测定Bcl-2和C-myc阳性细胞数量,实时荧光定量PCR和ELISA法分别检测法氏囊Bcl-2和C-myc 基因mRNA表达和蛋白含量。【结果】 ①REV感染1日龄SPF雏鸡后21~42 d,其法氏囊淋巴细胞凋亡百分比显著或极显著高于对照组雏鸡(P<0.05;P<0.01);②SPF雏鸡感染REV后21和28 d,其法氏囊细胞核浆比显著低于对照组雏鸡(P<0.05);③REV感染SPF雏鸡法氏囊中Bcl-2和C-myc阳性细胞数在病毒感染后21和28 d显著高于对照组雏鸡(P<0.05);④REV感染SPF雏鸡后21 d,其法氏囊Bcl-2和C-myc 基因mRNA表达极显著高于对照组雏鸡(P<0.01)。⑤SPF雏鸡感染REV后,其法氏囊中Bcl-2蛋白含量较对照组雏鸡有不同程度的增加,其中21和28 d分别差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05),病毒感染组雏鸡的C-myc蛋白含量也始终高于对照组雏鸡,且21和28 d极显著增高(P<0.01)。【结论】 REV感染所致SPF雏鸡法氏囊细胞Bcl-2和C-myc的mRNA表达以及蛋白含量异常均与病毒感染导致的法氏囊细胞凋亡密切相关,而法氏囊细胞凋亡数量增加与REV感染引发的机体免疫机能抑制密切相关。

【目的】 了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】 通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电镜观察、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)等方法鉴定,进行动物回归试验测定病毒毒力并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析。【结果】 分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30~60 nm的病毒粒子;RT-PCR结果显示,在约270 bp处可见单一条带,与DTMUV预期大小一致;Western blotting结果显示,在60 ku处有特异性条带,与E蛋白大小一致;IFA结果表明,接种病毒的DF-1细胞胞质中可见明亮的特异性荧光,以上结果均表明分离的病毒为DTMUV。将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌内注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远。与商品灭活疫苗毒株HB2010株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比,AX2020株第93、277和487位氨基酸发生了的突变。【结论】 成功分离得到1株DTMUV AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、高度接触性禽类烈性传染病,以呼吸道、消化道及神经系统症状为主要特征,在易感家禽中死亡率高达100%,给中国及世界养禽业和贸易往来带来了严重的经济损失。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是由病毒蛋白在感染过程中体外表达或自发组装而形成的不含病毒基因组、不能复制、不具有感染能力的病毒样蛋白颗粒。VLPs适宜的大小及独特的表面结构可被天然免疫细胞和分子有效识别,诱导良好的先天性免疫应答和适应性免疫应答,且VLPs不含病毒的感染性核酸,安全性较高,近年来成为疫苗领域中的研究热点。树突状细胞(dendritic cells,DCs)作为专职抗原递呈细胞,在连接天然免疫与适应性免疫之间具有独特功能,是目前抗原递呈能力最强的专职免疫细胞。成熟DCs (mature DCs,mDCs)迁移至次级淋巴组织能刺激初始型T细胞活化和增殖,被认为是特异性免疫应答的始动者,体外培养的不成熟DCs (immature DCs,imDCs) 也可辅助增强抗原递呈能力。NDV-VLPs主要是以NDV-M蛋白为骨架,来装配HN、F和NP蛋白,可表现出与活的NDV颗粒相似的外观和免疫原性。可见通过NDV-VLPs制成的疫苗同样具备安全、稳定、可刺激体液和细胞免疫应答、作为载体表达其他抗原及可设计成区分自然感染与免疫接种等诸多优点。文章主要就NDV-VLPs的相关内容展开探讨,以期为后续研究提供参考。

【目的】 获得鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)贵州流行株,以进一步开展其病原学及免疫学相关研究。【方法】 从贵州省织金县某肉鸡场共采集107份疑似MS感染病鸡的咽拭子、肿胀关节和脚垫、肿胀组织渗出物进行PCR检测,对PCR筛选的阳性组织样本进行MS分离培养,并进行瑞氏染色、生化试验及VlhA基因序列分析。【结果】 PCR检测筛选到20份阳性样本,从关节和爪垫阳性样本中分离到1株疑似MS,分离株在平板上生长出"煎蛋状"菌落;瑞氏染色可见蓝色细小的球形菌;生化试验中,分离株分解葡萄糖和麦芽糖,但不分解精氨酸、尿素等,与MS标准株生化结果一致;分离培养物经PCR扩增得到821 bp的目的片段;分离株VlhA基因核苷酸相似性分析表明该分离株为MS,与GenBank登录的国内其他地区流行株相似性有地域差异。与安徽、重庆、福建、广东、广西、湖北、湖南、江苏和云南等地区流行株相似性在90.3%~99.7%之间;该分离株与湖南MS流行株相似性最高,达到99.7%;但与国外参考流行株的相似性低;VlhA基因遗传进化树分析显示,该分离株与国内参考株亲缘关系较近,与国外参考株亲缘关系较远。【结论】 本研究成功从引起关节和足垫肿胀的鸡中分离鉴定了1株MS贵州流行株,该分离株存在一定变异,为贵州省MS的分子生物特征及本病的诊断和防控研究提供了基础依据。

【目的】 为快速有效评估宿主动物体内及周围环境中的羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)是否失活,本研究应用核酸染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)联合PCR扩增技术,以F1L基因为靶向检测对象,旨在建立一种针对具有感染活性OrfV的PMA-PCR检测方法。【方法】 将病毒悬液经不同温度相同时间的水浴处理,通过PCR确定病毒样本最佳的热灭活温度;分别设置PMA曝光时间梯度及浓度梯度,进一步对PMA的曝光时间和工作浓度等因素进行优化,确定有效区分具有感染活性OrfV和失活OrfV的PMA最佳处理条件;对所建立PMA-PCR方法进行特异性试验验证,并通过对不同数量比例的热灭活OrfV、活OrfV混合病毒悬液样本进行检测来验证该方法的敏感性。【结果】 OrfV样本经60 ℃热水浴处理10 min即可被完全灭活;PMA与失活OrfV的DNA共价结合且溶液中游离PMA光解的最佳曝光时间为15 min;热灭活OrfV基因组扩增被完全抑制的最小PMA浓度为20 μmol/L,活OrfV基因组扩增不受抑制的最大PMA浓度为35 μmol/L;特异性试验结果表明,该方法检测活OrfV时出现阳性条带,而口蹄疫病毒(FMDV)、绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)的扩增结果均呈阴性;经PMA处理后,在不同数量比例的活、热灭活OrfV病毒悬液中检测到活OrfV的灵敏度为10^-1.68 TCID₅₀/0.1 mL。【结论】 本试验成功建立了针对活OrfV的PMA-PCR检测技术,该方法特异性强、敏感度高,可为相关工作领域评估OrfV致病性提供技术参考。

【目的】 明确辣蓼黄酮提取物的毒理作用,评价其安全性。【方法】 在急性毒性试验预试验中,选取20只健康SPF级昆明系小鼠,随机分为6组,对照组(0 g/kg BW)和辣蓼黄酮提取物1~5组(灌胃给予辣蓼黄酮提取物20、10、5、2.5和1.25 g/kg BW),连续观察7 d,记录小鼠中毒和死亡情况。在急性毒性试验的最大给药量试验中,对20只小鼠分3次在24 h内按照30 g/kg BW灌胃给药,观察其生理状态,中毒情况及有无死亡情况,于试验第8天剖检观察其脏器有无异常情况。在亚慢性毒性试验中,取80只健康SPF级SD大鼠,随机分为4组,对照组(0 g/kg BW)和辣蓼黄酮高、中、低剂量组(分别灌胃给予辣蓼黄酮提取物20、10和5 g/kg BW),每组20只大鼠(雌、雄各半),喂养30 d,记录其体重、摄食量和饮水量。停药第7天,采血进行血常规和血液生化指标检查,计算其脏器指数,并进行组织病理学检查。【结果】 急性毒性试验各剂量组小鼠均未出现死亡情况,无法得出辣蓼黄酮提取物的半数致死量(LD₅₀),小鼠对辣蓼黄酮提取物的最大耐受量为30 g/kg BW,说明辣蓼黄酮提取物安全无急性毒性。亚慢性毒性试验中,各给药组大鼠体重、饮水量、采食量及脏器系数与对照组虽有差异,但在正常范围内。给药30 d血常规指标中,与对照组相比,高剂量组大鼠白细胞及淋巴细胞显著下降(P<0.05),中性粒细胞显著上升(P<0.05);中剂量组大鼠白细胞显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01);其余各组之间无显著差异(P>0.05)。血液生化指标中,与对照组相比,高剂量组大鼠甘油三酯(TG)水平显著上升(P<0.05),尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、总胆红素(TBIL)水平显著下降(P<0.05);中剂量组大鼠BUN水平显著下降(P<0.05),CREA水平显著上升(P<0.05),低剂量组大鼠谷丙转氨酶(ALT)、TG水平显著上升(P<0.05),BUN水平显著下降(P<0.05),其余各组间均无显著差异(P>0.05)。剖检和病理学检查未见明显异常变化,说明辣蓼黄酮提取物安全无亚慢性毒性。【结论】 5 g/kg BW及以下的辣蓼黄酮提取物无毒副作用,安全性好。

【目的】 通过网络药理学对丹参、益母草、黄芩、连翘组成的中药复方进行分析,研究其有效成分治疗奶牛子宫内膜炎的潜在作用靶点,并对靶点作用通路的机制进行阐述。【方法】 利用TCMSP数据库筛选药物成分作用靶点,通过NCBI、GeneCard、geneMap、TTD、DrugBank查找奶牛子宫内膜炎的相关靶点,筛选出药物成分靶点与奶牛子宫内膜炎相关靶点的共有基因靶点,作为该中药复方治疗奶牛子宫内膜炎的预测靶点,并上传到STRING数据库建立蛋白互作(PPI)网络,通过Cytoscape 3.8.2软件根据连接度对PPI网络进行筛选,找到其核心靶点。运用Metascape数据库对核心靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析。【结果】 从该中药复方中筛出有效活性成分133种,主要包括槲皮素、山奈酚、黄芩素、丹参酮ⅡA等,通过药物成分找到对应靶点蛋白292个,通过数据库找到奶牛子宫内膜炎的相关靶点130个,筛出中药复方治疗奶牛子宫内膜炎的预测靶点24个,其中核心靶点7个,包括肿瘤坏死因子、蛋白激酶、前列腺素内过氧化物合酶2等。GO功能富集分析得到生物过程20个条目、分子功能6个条目及细胞组分6个条目,生物过程包括脂多糖的反应、白细胞-细胞黏附的正向调节、对无机物的反应等;分子功能包括信号受体活性调节、转录辅激活子的结合、血红素结合等;细胞组分包括细胞膜筏、薄膜侧面、颗粒分泌腔等。KEGG通路富集分析涉及20个基因,参与调控的通路有9条,其中涉及基因较多的包括AGE-RAGE信号通路、癌症蛋白聚糖通路、血流剪切应力与动脉粥样硬化通路及Th17细胞分化通路。【结论】 该中药复方可能是通过调控肿瘤坏死因子、蛋白激酶、前列腺素内过氧化物合酶2等靶点,通过参与AGE-RAGE信号通路及Th17细胞的分化对奶牛子宫内膜炎产生治疗作用。

【目的】 分离鉴定武汉市患皮肤病犬猫细菌性病原,并探索其对传统抗菌药物与天然活性产物藤黄酸(GA)和6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)的敏感性。【方法】 对患皮肤病犬猫采样并分离病原,通过生长特性观察、革兰氏染色镜检、PCR等方法鉴定并利用SPF小鼠验证致病性;通过药敏纸片验证其对传统药物的耐药性,并测定天然产物对其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值。【结果】 分离得到2株金黄色葡萄球菌、3株伪中间型葡萄球菌、2株猫葡萄球菌、1株犬链球菌及1株奇异变形杆菌。SPF小鼠皮肤创伤感染验证分离菌株均有致病性。犬链球菌及奇异变形杆菌对各自受试药物均敏感;葡萄球菌对复方新诺明、青霉素、红霉素、四环素、左氧氟沙星、苯唑西林、庆大霉素、克林霉素及氯霉素存在不同程度耐药。天然活性产物GA和BIO对上述9株菌均具有良好抑菌效果,且除分离菌株F5外GA对分离菌株的MIC值均小于BIO。【结论】 本研究共分离得到5种、9株犬猫皮肤细菌。犬链球菌、奇异变形杆菌对传统抗菌药物均敏感,部分葡萄球菌存在耐药。GA和BIO对犬猫皮肤病原菌均有明显抑菌活性,显示其可作为防控犬猫细菌性皮肤病的候选药物。

【目的】 研究穿王消炎粉对脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)的治疗作用。【方法】 将60只SD雄性大鼠随机分入空白组、左氧氟沙星阳性药物对照组、LPS模型组及穿王消炎粉低(1 g/kg体重)、中(2 g/kg体重)、高(4 g/kg体重)剂量组,每组10只。模型组和给药组大鼠经滴鼻法给予LPS(3 mg/kg体重)制备大鼠ALI模型,24 h后,给药组分别灌胃相应浓度的穿王消炎粉,模型组和空白组灌胃相同体积的生理盐水。治疗4 d后处死大鼠,分离血清、固定并冻存肺脏组织。测定各组大鼠肺脏组织湿/干重比;HE染色观察大鼠肺脏组织病理学变化;ELISA法检测血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6含量;采用实时荧光定量PCR和Western blotting法检测肺脏组织中IL-1β、IL-6 mRNA表达水平和蛋白表达量。【结果】 与空白组相比,LPS模型组大鼠出现肺间质壁增厚,肺泡腔内炎性细胞浸润、出血,肺泡结构破坏等肺损伤症状,肺组织的湿/干重比极显著升高(P<0.01),血清中IL-1β、IL-6含量和肺脏组织中IL-1β、IL-6 mRNA表达水平及蛋白表达量均显著增加(P<0.05)。与LPS模型组相比,各给药组大鼠肺间质增宽现象有所改善,肺组织的湿/干重比、血清和肺脏组织中炎性因子IL-1β、IL-6 mRNA表达水平及蛋白表达量均显著降低(P<0.05)。【结论】 穿王消炎粉可有效抑制LPS诱导的急性肺部损伤和炎症程度。

【目的】 建立一种简便、快速、灵敏度高、特异性强的头孢氨苄免疫层析表面增强拉曼光谱(SERS)检测新方法。【方法】 制备金银复合核壳结构的纳米贵金属,用来标记头孢氨苄抗体和拉曼信号分子5,5’-二硫代双2-硝基苯甲酸 (DTNB),合成拉曼免疫探针,用透射电子显微镜和双光束紫外分光光度计对纳米金和修饰拉曼信号分子的金银复合核壳结构进行表征。将合成的拉曼免疫探针固定在微孔板上,待测样品中的头孢氨苄与包被在硝酸纤维素膜上的头孢氨苄抗原竞争结合拉曼免疫探针,通过免疫层析试纸条结合共聚焦拉曼光谱仪读取DTNB的信号值,建立头孢氨苄定量检测技术,并应用于实际牛奶样品的检测。【结果】 透射电子显微镜和双光束紫外分光光度计表征结果显示,纳米银成功包裹在金颗粒表面。用共聚焦拉曼光谱仪检测免疫层析试纸条上拉曼信号分子的特征峰,拉曼信号分子特征峰为1 062、1 154、1 334和1 558 cm^-1,其中1 334 cm^-1处特征峰信号最强,选取此处峰高定量测定头孢氨苄的含量。头孢氨苄免疫层析表面增强拉曼光谱检测的线性范围为0~1 ng/mL,检测限为0.001 ng/mL,头孢氨苄的半数抑制质量浓度为0.05 ng/mL。与头孢克洛交叉反应率为111.1%,与头孢曲松钠、头孢夫辛酯、头孢噻吩钠交叉反应率均低于0.1%。实际样品加标浓度为1、4和8 ng /mL,回收率分别为94.4%、103.3%和97.5%。【结论】 本研究建立的头孢氨苄免疫层析表面增强拉曼光谱检测方法操作简便、快速、灵敏,耗材成本低廉,可满足奶牛养殖农场和乳品加工企业进行大批量样品初筛检测需求。

【目的】 探究原儿茶酸对脂多糖(LPS)诱导的小鼠子宫内膜炎的作用机制。【方法】 将60只小鼠随机分为对照组、LPS组、LPS+不同浓度原儿茶酸(20、40、80 mg/kg)组共5组,每组各12只。对照组小鼠用微量注射器经阴道灌注50 mL生理盐水,LPS组灌注50 mL LPS(1 mg/kg),原儿茶酸治疗组灌注50 mL LPS前1 h分别腹腔注射20、40、80 mg/kg原儿茶酸,注射24 h后,颈椎脱臼法处死所有小鼠。收集子宫组织,通过HE染色检测子宫组织病理变化,用试剂盒检测髓过氧化物酶(MPO)活性,ELISA法检测炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6含量;Western blotting法检测p65、核因子-κB(NF-κB)的抑制蛋白(IκB)以及磷酸化p65、IκB(p-p65、p-IκB)蛋白表达水平。【结果】 组织病理结果显示,对照组小鼠子宫组织形态正常,子宫内膜上皮结构正常;LPS组小鼠子宫组织出现严重的炎性细胞浸润和子宫内膜上皮充血及水肿。与LPS组相比,随着原儿茶酸浓度的增加,小鼠子宫组织中炎性细胞明显减少,子宫内膜上皮充血水肿情况也明显得到改善。MPO活性检测表明,与对照组相比,LPS组MPO活性极显著升高(P<0.01);与LPS组相比,原儿茶酸治疗组MPO活性均极显著降低(P<0.01),并呈剂量依赖性。ELISA结果表明,与对照组相比,LPS组小鼠子宫内膜组织中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均极显著升高(P<0.01);与LPS组相比,原儿茶酸治疗组小鼠子宫内膜组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量均极显著降低(P<0.01),并呈剂量依赖性。Western blotting结果表明,与对照组相比,LPS组p-p65和p-IκB的表达水平均极显著升高(P<0.01);与LPS组相比,原儿茶酸治疗组p-p65和p-IκB的表达水平均极显著降低(P<0.01),且呈剂量依赖性。【结论】 原儿茶酸通过减轻子宫组织的病理变化,降低子宫组织MPO活性,抑制NF-κB信号通路及炎症细胞因子的产生,对LPS诱导的小鼠子宫内膜炎起到保护作用。

【目的】 了解广东省不同地区猪源十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis,简称贾第虫)的流行现状和分子特征,并评估其人兽共患风险。【方法】 从广东省10个地区采集新鲜猪粪样品,采用显微镜镜检,并应用巢式PCR对贾第虫谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,gdh)基因进行扩增,根据扩增结果计算不同地区和生长阶段猪贾第虫的阳性率。对所有的PCR阳性产物进行测序,将获得的贾第虫gdh基因序列进行BLAST比对,确定贾第虫的基因型;运用Mega 7.0软件的最大似然法构建进化树。【结果】 贾第虫包囊呈椭圆形,囊壁较厚,大小为(10~14)μm ×(7~10)μm,具有明显纵向轴柱,细胞核分布于轴柱两侧。521份受检样品中共检测出94份PCR阳性样品,阳性率为18.04%(94/521),其中茂名和清远的阳性率较高,分别达40.00%(10/25)和35.06%(27/77);肇庆和韶关的阳性率较低,分别为3.90%(3/77)和8.57%(3/35);佛山、江门、阳江、河源、广州和惠州的阳性率分别为11.11%(2/18)、15.31%(15/98)、11.43%(4/35)、13.33%(4/30)、9.38%(3/32)和24.47%(23/94)。不同饲养阶段的猪群的阳性率调查发现,母猪的贾第虫阳性率(24.55%)显著高于断奶仔猪(13.30%)(P<0.05),与育肥猪的贾第虫阳性率(19.23%)差异不显著(P>0.05)。基于gdh基因序列的基因分型和系统进化分析共发现5种贾第虫亚集聚体,即集聚体AⅠ和集聚体E的4种不同亚型,包括集聚体E1、E2、E10和E13,其中61.70%(58/94)测序阳性样品属于集聚体AⅠ,38.30%(36/94)属于集聚体E的不同亚型。【结论】 广东猪源贾第虫的感染较普遍,不同地区和不同生长阶段的猪感染率存在一定差异。其中,人兽共患性集聚体AⅠ为优势亚集聚体,表明广东省猪源贾第虫存在人兽跨物种传播的风险,应重视该病可能引起的公共卫生问题。