【目的】对秦川肉牛纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI1)基因进行生物信息学分析,检测PAI1基因在秦川肉牛不同组织中的表达水平并研究其功能,为秦川肉牛肌内脂肪沉积的分子育种提供理论依据。【方法】以分离自秦川肉牛背最长肌的肌内脂肪细胞为试验材料,PCR扩增PAI1基因CDS区,对所获序列进行相似性分析及系统进化树构建,并通过生物信息学软件预测其编码蛋白的结构和功能。通过实时荧光定量PCR检测PAI1基因在秦川肉牛不同组织中的表达量。合成PAI1基因siRNA并转染秦川肉牛肌内脂肪细胞,试验分为两组:对照组(NC)和干扰组(si-PAI1),通过EdU染色、CCK-8检测、流式细胞术、油红O染色观察表型变化,采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测转录和翻译水平标志基因(PCNA、CDK1、CCND2、PPARG、PLIN2、FABP4)的表达。【结果】试验成功扩增出PAI1基因CDS区,大小为1 054 bp。牛PAI1基因氨基酸序列与水牛、山羊、人、小鼠、绵羊、黑猩猩的相似性分别为96.8%、95.8%、85.3%、76.9%、95.8%和85.3%。系统进化树表明,牛与水牛的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系最远。生物信息学分析发现,细胞周期相关激酶参与了PAI1基因的磷酸化修饰;PAI1蛋白二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主;PAI1基因启动子上游2 000 bp存在成脂相关转录因子的结合位点。实时荧光定量PCR结果发现,PAI1基因在秦川肉牛各组织中均有表达,其中在肾周脂肪中的表达量最高,在背最长肌中的表达量最低。干扰PAI1基因后,与对照组相比,干扰组处于增殖期的细胞数量明显增多,CDK1、PCNA和CCND2基因mRNA表达水平极显著或显著上调(P＜0.01;P＜0.05),CDK1和PCNA蛋白表达水平明显增加。随着肌内脂肪细胞的分化,与对照组相比,干扰组脂滴数量明显增加,PPARγ、PLIN2和FABP4基因mRNA表达水平均极显著上调(P＜0.01)。【结论】PAI1基因在物种间的保守性较强,可能通过磷酸化和转录因子参与肌内脂肪细胞的增殖和分化,干扰PAI1基因可促进肌内脂肪细胞的增殖和分化,提示该基因可能对肌内脂肪的沉积有重要的调控作用。

【目的】了解多杀性巴氏杆菌中CRISPR-Cas系统的结构特征及cas基因的分布,为不同CRISPR亚型的应用及多杀巴氏杆菌的抗病毒进化研究提供基础。【方法】通过CRISPRCasfinder在线网站筛选多杀性巴氏杆菌基因组中的CRISPR簇和cas基因;通过生物信息学方法对各亚型系统中repeat和spacer序列保守性、repeat二级结构、cas基因核苷酸序列保守性、CRISPR簇相似性等进行分析。【结果】在选取的19株多杀性巴氏杆菌基因组中均存在Ⅰ-F、Ⅱ-C、Ⅲ-A亚型CRISPR系统。在相同亚型的CRISPR系统中repeat序列有着较保守的回文重复序列,但在不同CRISPR亚型中repeat序列差异较大。Ⅱ-C亚型的tracrRNA可以与crRNA形成保守的结构。在各亚型CRISPR系统中,新获取的spacer序列可以插入到CRISPR簇的5'-端、3'-端或中间位置。通过对各菌株spacer序列分析发现,在菌株内或菌株间的CRISPR序列中均存在着相同的spacer序列,这可能与细菌在遗传进化过程中repeat-spacer发生序列重组或基因水平转移产生的趋同进化有关。【结论】19株多杀性巴氏杆菌中含有Ⅰ-F、Ⅱ-C、Ⅲ-A 3种CRISPR-Cas系统,不同CRISPR亚型中repeat序列差异较大,spacer特征性重复的分布可能与多杀性巴氏杆菌在遗传进化过程中repeat-spacer发生序列重组有关。

【目的】获取鸡小黄卵泡颗粒细胞(granulosa cells of small yellow follicle,SYFG)全长转录组数据,为深入挖掘鸡卵泡发育内在分子调控信息提供参考。【方法】采用PacBio高通量测序平台,对海兰褐壳蛋鸡SYFG进行测序、过滤、聚类和矫正原始数据,获取全长转录本序列。通过生物信息学软件对全长转录本数据进行功能注释、转录因子注释、编码区序列(coding sequence,CDS)预测、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)预测筛选、简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)检测及可变剪接(alternative splicing,AS)和选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)分析。【结果】通过测序共获得52 311条海兰褐壳蛋鸡SYFG全长转录本,长度主要分布于1~3 500 bp。通过与GO、KEGG、COG、NR、Swiss-Prot和Pfam数据库比对,对转录本序列进行注释,其中GO数据库注释了26 525条转录本,KEGG数据库注释了25 233条转录本,COG数据库注释了31 303条转录本,NR数据库注释了34 284条转录本,Swiss-Prot数据库注释了30 701条转录本,Pfam数据库注释了24 622条转录本。此外,经鉴定或预测,还获得了559个转录因子、40 944个CDS、14 699个lncRNAs、7种类型的SSR、28 423个AS和2 747个APA事件。【结论】本研究获得了鸡SYFG全长转录组测序数据,提升了转录本的数量和长度,完善了转录本的功能注释,分析了AS和APA事件的类型,揭示了转录本的复杂性,为进一步从转录组水平解析鸡卵泡发育的分子调节机制提供数据支持。

【目的】分析2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(2-deoxyriboaldolase,DERA)CDS区序列特征及其在静原鸡不同组织和不同生长发育时期的表达水平,为进一步研究DERA基因在静原鸡肌肉中的调控机制提供参考。【方法】以42日龄静原鸡胸肌cDNA为模板,克隆DERA基因完整CDS区,测序并进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术检测DERA基因在静原鸡不同生长发育阶段(7、42、126、180日龄)胸肌、腿肌和42日龄不同组织(心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胸肌和腿肌)中的表达水平。【结果】静原鸡DERA基因CDS区全长699 bp,编码232个氨基酸,与环颈雉的相似性最高,为99.1%,表明DERA蛋白氨基酸序列在进化过程中保守性较高。DERA属于稳定蛋白,平均亲水系数为0.175,属于疏水性蛋白;存在跨膜结构,没有信号肽,属于跨膜蛋白。蛋白结构域是一种deoC/LacD家族醛缩酶域,二级结构包含α-螺旋、延伸链和无规则卷曲。蛋白互作网络分析表明,DERA蛋白与PGM2、TPI1、TKT等蛋白存在互作关系。DERA基因在静原鸡肾脏、胸肌、腿肌、心脏、肝脏、肺脏、脾脏中均有表达,其中在肾脏和胸肌中的表达量较高,均显著高于其他组织(P＜0.05);在肺脏和脾脏中的表达量较低,均显著低于其他组织(P＜0.05);DERA基因在7日龄胸肌和腿肌组织中的表达量均显著高于42、126和180日龄(P＜0.05)。【结论】试验成功获得静原鸡DERA基因完整CDS区序列,该基因在静原鸡不同生长发育阶段胸肌和腿肌中的表达量以7日龄最高,且在42日龄静原鸡不同组织中以肾脏和胸肌中的表达量较高。结果为进一步研究DERA基因在静原鸡肌肉发育中的作用机制提供参考。

【目的】筛选并鉴定在牦牛骨骼肌中特异表达的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族成员及其功能相关基因,以期为研究牦牛骨骼肌结构形成机制提供依据。【方法】采集成年公牦牛臀肌和胸肌,利用组织化学染色法(HE和Masson)分析肌纤维特征和胶原纤维数量;通过实时荧光定量PCR鉴定MMPs和基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)的mRNA表达量;采用Western blotting技术和免疫组织化学法分析MMPs、Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的表达量和组织分布;通过STRING网站分析MMPs及其功能相关基因之间的蛋白质互作网络;采用EnzChek^TM明胶酶/胶原酶试剂盒检测牦牛臀肌和胸肌中明胶酶/胶原酶的酶活性差异。【结果】Masson染色和实时荧光定量PCR分析结果显示,牦牛臀肌中胶原纤维面积、MMP-2和MMP-14基因表达量显著低于胸肌(P＜0.05),TIMP-3基因在牦牛臀肌中表达量显著高于胸肌(P＜0.05)。Western blotting鉴定发现,MMP-3、MMP-14、Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白在牦牛臀肌中的表达量极显著或显著低于胸肌(P＜0.01;P＜0.05)。免疫组织化学法分析显示,MMP-2、MMP-9、MMP-14和Ⅰ型胶原蛋白在牦牛臀肌中的表达量显著或极显著低于胸肌(P＜0.05;P＜0.01),而MMP-16在牦牛臀肌中的表达量显著高于胸肌(P＜0.05)。蛋白质功能相关性聚类分析表明,MMP-2、MMP-14、MMP-16、TIMP-2、TIMP-3、COL1A2和COL3A1可聚为一簇,MMP-3、MMP-9和TIMP-1可聚为一簇;臀肌和胸肌中明胶酶/胶原酶的酶活性变化趋势一致,且差异不显著(P＞0.05)。【结论】MMPs家族成员及其功能相关基因在牦牛骨骼肌中广泛表达,且在臀肌和胸肌中的表达量存在差异,为进一步研究MMPs调控牦牛骨骼肌结构形成的作用机制提供了参考依据。

【目的】通过生物信息学方法分析1株禽白血病病毒(Avian Leukosis virus,ALV)的囊膜蛋白env的分子特征。【方法】利用鸡成纤维细胞(DF-1)培养疑似禽白血病病鸡的血清样品,通过ELISA和实时荧光定量PCR鉴定ALV亚群。对env基因PCR产物进行测序,利用SeqMan拼接env基因。将该env基因与国内外多个ALV亚群进行序列比对及遗传进化分析,并借助多种生物信息学软件对env蛋白进行分析,包括理化性质、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点、乙酰化位点、二级结构、三级结构、抗原决定簇和B细胞抗原表位预测。【结果】ALV-J毒株的env基因全长1 719 bp,获得GenBank登录号为OP837418,其与J亚群ALV位于同一进化分支,相似性为89.3%~94.8%。该env蛋白有2个跨膜区,是由572个氨基酸组成的不稳定的亲水蛋白,不稳定系数预测值为43.49,总平均亲水性为―0.201;该env蛋白为非分泌蛋白,无信号肽,有17个N-糖基化修饰位点、77个O-糖基化修饰位点、42个磷酸化修饰位点、21个潜在抗原决定簇和9个连续碱基数超过10个的B细胞线性表位。该env蛋白的二级结构中无规则卷曲占比最大,为38.29%。【结论】env基因是导致ALV遗传变异的关键基因,其编码的囊膜蛋白env具有不稳定性,存在多个蛋白修饰位点和抗原表位。

【目的】了解陆川猪肌球蛋白轻链2(myosin light chain 2,MYL2)基因CDS区序列及其编码蛋白的结构和功能,探究MYL2基因对肌肉生长发育的影响,为陆川猪的开发利用提供分子基础。【方法】采用RT-PCR技术扩增陆川猪MYL2基因CDS区,利用MegAlign软件对陆川猪MYL2基因与不同物种进行相似性比对和系统进化树构建,并通过生物信息学软件分析MYL2蛋白理化性质、疏水性和跨膜结构等;构建MYL2基因真核表达载体,利用脂质体法将重组质粒转染C2C12细胞并观察荧光;通过实时荧光定量PCR检测MYL2基因在陆川猪不同组织中的表达情况。【结果】陆川猪MYL2基因CDS区全长501 bp,编码166个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MYL2基因相似性为99.6%,存在2处突变:156 bp处C突变为T,为同义突变;404 bp处T突变为C,使异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T)。生物信息学分析显示,MYL2蛋白原子总数为2 633个,分子质量为18.879 ku,理论等电点(pI)为4.83,不存在跨膜结构,无信号肽,为非分泌蛋白。MYL2蛋白有16个位点可能会被磷酸化,在第78位氨基酸有1个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,MYL2蛋白主要存在于细胞质(56.5%)、细胞骨架(21.7%)、线粒体(8.7%)、细胞核(8.7%)和液泡(4.3%)中。MYL2蛋白二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、β-转角和延伸链组成,占比分别为57.83%、29.52%、9.04%和3.61%。细胞试验结果显示,转染48 h后试验组和对照组均有荧光,与对照组相比,试验组MYL2基因表达量极显著升高(P＜0.01)。不同组织中MYL2基因表达量由高到低依次为心脏、背最长肌、肝脏、皮下脂肪、肺脏、脾脏和肾脏,且在背最长肌中的表达量显著高于除心脏外的其他组织(P＜0.05)。【结论】本试验成功克隆陆川猪MYL2基因CDS区,构建了真核表达载体和组织表达谱,并对其所编码蛋白的结构和功能进行了分析,为探究MYL2基因在肌肉生长发育中的作用及陆川猪的开发利用提供了分子依据。

【目的】试验旨在对鸡胚胎致死性异常视觉蛋白1(embryonic lethal abnormal vision like 1,ELAVL1)基因的CDS区进行克隆、表达和生物信息学分析。【方法】以鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast,CEF)cDNA为模板,通过PCR方法扩增ELAVL1基因CDS区序列,构建pMD19-T-ELAVL1克隆质粒。以pMD19-T-ELAVL1为模板进一步构建pET-32a-ELAVL1原核重组表达质粒,使用IPTG对重组菌株进行诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白表达情况。通过在线软件对ELAVL1蛋白进行生物信息学分析。【结果】鸡ELAVL1基因CDS区长981 bp,编码326个氨基酸,与鸭的亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,诱导表达重组蛋白主要以可溶性形式表达,其分子质量大小约55 ku。生物信息学分析显示,ELAVL1蛋白分子质量为36.10 ku,分子式为C₁₅₈₇H₂₄₉₄N₄₅₈O₄₇₉S₁₄,为非脂溶性、弱碱性的亲水稳定蛋白。ELAVL1蛋白无信号肽与跨膜区,含有1个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、32个磷酸化位点和10个线性B细胞抗原表位结合位点。该蛋白主要位于细胞核中,二级结构及三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,含有3个RNA识别基序(RNA recognition motif,RRM),预测可能与多种RNA结合蛋白和蛋白激酶存在相互作用。【结论】本试验成功克隆了鸡ELAVL1基因CDS区,其编码蛋白为非脂溶性、弱碱性的亲水稳定蛋白,经诱导表达后成功获得了可溶性表达的ELAVL1重组蛋白。本研究结果为进一步探究鸡ELAVL1基因功能提供科学依据。

【目的】探究在体外成熟培养基中添加罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对小鼠卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响,为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】通过在体外成熟培养基中添加0、10、20、50、100 μmol/L RSG,统计第一极体(PBⅠ)排出率,确定RSG最适浓度。根据RSG最适浓度筛选结果分为对照组和罗格列酮组,通过免疫荧光染色法检测卵母细胞内活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、组织蛋白酶B(CB)、线粒体膜电位水平(MMP)及囊胚内总细胞数(Hoechst 33342)和细胞凋亡比率(TUNNEL);使用实时荧光定量PCR检测囊胚内抗氧化相关基因(Sod-2、Gpx-3和Cat)和凋亡相关基因(Caspase-3、Bcl-2和Bcl-xl)转录水平。【结果】与对照组相比,添加20 μmol/L RSG可显著提高小鼠卵母细胞第一极体排出率、卵裂率及囊胚率(P＜0.05);卵母细胞内ROS和CB水平均显著降低,GSH和线粒体膜电位水平均显著提高(P＜0.05);囊胚内总细胞数显著提高,细胞凋亡比率显著降低(P＜0.05);抗氧化相关基因(Sod-2、Gpx-3和Cat)和抗凋亡相关基因(Bcl-2和Bcl-xl)转录水平显著提高,促凋亡基因Caspase-3转录水平显著降低(P＜0.05)。【结论】在体外成熟培养基中添加RSG对卵母细胞内氧化还原稳态有积极作用,可改善线粒体功能,提高卵母细胞体外受精后发育能力,并降低卵母细胞内CB水平及囊胚内细胞凋亡的发生。

【目的】试验旨在揭示茶树菇多糖(Agrocybe aegerita polysaccharid,AAP)对小鼠脾脏淋巴细胞免疫调节的影响,为阐明AAP的作用机制及其临床应用提供依据。【方法】以小鼠脾脏淋巴细胞为研究对象,用噻唑蓝(MTT)比色法测定AAP对淋巴细胞的安全浓度,以安全浓度进行后续试验;用MTT法检测不同浓度AAP对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响,同时设置细胞、脂多糖(LPS)和植物血凝素(PHA)3个对照组,筛选出对小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力较强的浓度,用流式细胞仪检测其对T淋巴细胞亚型CD4⁺/CD3⁺和CD8⁺/CD3⁺比值的影响,利用ELISA法检测其对淋巴细胞上清液中白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和γ-干扰素(IFN-γ)含量的影响。【结果】低于1 000 μg/mL AAP对小鼠脾脏淋巴细胞不产生毒性作用。与对照组相比,不同浓度AAP均可极显著协同LPS和PHA刺激淋巴细胞增殖(P＜0.01);125和250 μg/mL AAP可极显著提高CD4⁺/CD3⁺和CD8⁺/CD3⁺比值(P＜0.01),显著或极显著升高淋巴细胞分泌的细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ含量(P＜0.05;P＜0.01)。【结论】AAP可协同LPS和PHA刺激小鼠脾脏淋巴细胞增殖,提高淋巴细胞表面CD4⁺/CD3⁺和CD8⁺/CD3⁺比值及淋巴细胞释放细胞因子的能力,进而提高机体免疫功能。

【目的】以蝇蛆抗氧化肽(FTP)为研究对象,利用体外化学和细胞试验,探究FTP对DPPH和ABTS⁺·自由基清除能力以及对IPEC-J2细胞氧化应激损伤的保护作用。【方法】通过测定不同浓度(500、1 000、2 000、3 000、4 000 μg/mL)FTP对DPPH、ABTS⁺·自由基的清除率检测FTP的体外抗氧化能力;将IPEC-J2细胞用不同浓度(0、100、250、500、1 000、2 000 μg/mL)FTP培养,利用MTT法测定孵育24 h后各组细胞的存活率;利用MTT法筛选出适宜的过氧化氢(H₂O₂)浓度构建氧化应激模型;根据构建的氧化应激模型和FTP适宜的浓度梯度,将IPEC-J2细胞随机分为空白组、模型组、试验组(100、250、500、1 000 μg/mL),分别测定各组细胞存活率、活性氧(ROS)水平以及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)水平。【结果】当FTP浓度为4 000 μg/mL时DPPH和ABTS⁺·自由基的清除率分别达到了54.82%和81.90%;不同浓度FTP对IPEC-J2细胞均无生长抑制作用,细胞存活率均高于100%,呈浓度梯度性增长,且FTP浓度为2 000 μg/mL的细胞存活率是空白组的1.22倍;H₂O₂构建细胞氧化应激模型的适宜浓度为1 000 μmol/L。与空白组相比,模型组细胞存活率极显著降低,ROS和MDA水平极显著提高,SOD和CAT活性极显著降低(P＜0.01);与模型组相比,4个试验组细胞存活率均极显著增高(P＜0.01),500 μg/mL FTP组细胞存活率是模型组的2.37倍,500和1 000 μg/mL FTP组的ROS和MDA水平极显著降低(P＜0.05),SOD和CAT活性极显著或显著升高(P＜0.01;P＜0.05),且均呈剂量效应关系。【结论】FTP对IPEC-J2细胞氧化应激损伤有显著的保护作用,且呈剂量效应。

【目的】研究不同菌发酵杜仲叶对肉鸡生产性能、抗氧化性能、脏器及肠道免疫相关基因表达的影响,为新型替抗添加剂的研发提供科学依据。【方法】将基础饲粮(A组)及屎肠球菌发酵杜仲叶(B组)、植物乳杆菌发酵杜仲叶(C组)、屎肠球菌和植物乳杆菌混合发酵杜仲叶(D组)饲粮饲喂肉鸡,在第28和56天分别称重,计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G);心脏采血检测血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)指标;采集肉鸡脾脏、肝脏、回肠组织,利用实时荧光定量PCR检测γ-干扰素(IFN-γ)、一氧化氮合成酶(iNOS)、白细胞介素6(IL-6)和IL-10基因表达量。【结果】①与A组相比,1~28和1~56 d,B、C、D组ADG显著提高,F/G显著降低(P＜0.05);29~56 d,B、C组ADG显著提高,B、C、D组F/G显著降低(P＜0.05)。②饲喂28、56 d,B、C组GSX-Px活性显著高于A组(P＜0.05)。③与A组相比,饲喂28 d,B、C、D组脾脏以及D组回肠IFN-γ基因mRNA表达量均显著提高(P＜0.05);饲喂56 d,B、D组肝脏以及B、C、D组脾脏、回肠IFN-γ基因mRNA表达量均显著提高(P＜0.05)。④与A组相比,饲喂28 d,B、D组回肠IL-6基因mRNA表达量显著降低(P＜0.05);饲喂56 d,D组肝脏、C和D组脾脏以及B、D组回肠IL-6基因mRNA表达量均显著降低(P＜0.05)。⑤与A组相比,饲喂28 d,B、D组回肠IL-10基因mRNA表达量显著提高(P＜0.05);饲喂56 d,B、C、D组肝脏及回肠IL-10基因mRNA表达量均显著提高(P＜0.05)。⑥与A组相比,饲喂28 d,D组脾脏及B、C、D组回肠iNOS基因mRNA表达量均显著提高(P＜0.05);饲喂56 d,C、D组肝脏、脾脏以及B、C、D组回肠iNOS基因mRNA表达量均显著提高(P＜0.05)。【结论】在饲料中添加不同益生菌发酵杜仲叶能促进肉鸡生产性能,并对血清抗氧化指标及肠道免疫相关基因产生影响。

牛个体识别技术是实现牛的智能测重、体况评分、体型鉴定、行为监测等自动化技术的先决条件,各种用于牛个体识别的设备和方法在不同的时间段被提出。作者首先对不同牛个体识别方法进行分类阐述,介绍了传统识别方法、生物特征识别方法和深度学习方法在牛个体识别中的研究进展,特别是当前深度学习方法在实际应用中的难点,然后详细分析了不同识别方法的优缺点。传统识别方法如耳切、耳纹、热烙等方法,依靠人工对牛进行识别,识别准确率和识别效率低,忽视了动物福利和标记持久性;无线射频识别技术将牛个体识别由人工识别转向了自动识别,提高了识别效率,但数据安全无法得到保障。随着图像识别技术的发展和深度学习方法的崛起,基于生物特征识别方法和深度学习方法的牛个体识别技术实现了非接触、安全高效的牛智能识别,但基于鼻纹印、视网膜血管和虹膜的生物特征识别方法因理想图像获取难度较大,实用性较差。深度学习方法通过深度神经网络学习图像特征,更适用于复杂条件下的图像应用,在真实的牛场养殖环境中具有广泛的应用前景和潜在价值。作者还对比了不同识别方法在各方面的差异,并在此基础上对牛个体识别技术的研究前景进行了展望。

【目的】研究饲粮中添加姜黄素对生长期海南屯昌猪生长性能、血清生化指标和饲料养分表观消化率的影响。【方法】选取健康、体重(35.88 kg±0.25 kg)接近的80头海南屯昌猪,随机分成5组,每组4个重复,每个重复4头猪,其中对照组饲喂基础饲粮,抗生素组在基础饲粮中添加300 mg/kg硫酸黏膜杆菌素,3个试验组分别在基础饲粮中添加200(姜黄素1组)、400(姜黄素2组)和600 mg/kg(姜黄素3组)姜黄素。预饲期7 d,正试期50 d。试验第51天早上称重,计算生长性能;从每组随机选取6头猪静脉采血,检测血清生化指标;每个重复随机收集3头猪的新鲜粪便,测定饲料养分表观消化率。【结果】与对照组相比,姜黄素3组猪平均日增重(ADG)提高23.82%(P＜0.05);料重比(F/G)降低20.06%(P＜0.05);血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性和二氨氧化酶(DAO)含量分别降低22.23%和29.31%(P＜0.05);血清IgA含量提高21.14%(P＜0.05)。与抗生素组相比,姜黄素3组猪平均日增重(ADG)提高23.09%(P＜0.05);粗纤维表观消化率提高42.14%(P＜0.05);血清AST活性降低31.75%(P＜0.05)。姜黄素2组猪平均日增重与对照组和抗生素组均无显著差异(P＞0.05),粗纤维表观消化率极显著高于对照组和抗生素组(P＜0.05);与对照组相比,姜黄素1、2组猪血清D-乳酸和DAO含量均显著降低(P＜0.05)。【结论】饲粮中添加600 mg/kg姜黄素可以提高生长期海南屯昌猪的生长性能和粗纤维表观消化率,提升机体免疫状态,具有替代抗生素的潜力。

【目的】研究发酵杂交构树对湖羊生长性能、肉品质、消化酶活力和肠道菌群的影响,为杂交构树在肉羊养殖中的应用提供科学数据。【方法】选取72只健康状况良好、体重相近的湖羊,随机分为4组,每组6个重复,每个重复3只。对照组(CG)饲喂基础饲粮,试验组(EG1、EG2、EG3)在基础饲粮中分别添加16%、24%和32%发酵杂交构树,预饲期14 d,试验期90 d。试验结束后测定湖羊的体重,从各重复中随机选取1只羊屠宰,取后腿股部肌和背最长肌、空肠中段内容物以及盲肠内容物进行肉品质、消化酶活力和肠道菌群变化的测定。【结果】与对照组相比,①饲粮中添加不同比例发酵杂交构树试验羊平均日采食量、平均日增重、料重比均无显著差异(P＞0.05)。②后腿股部肌中,EG3组剪切力显著降低(P＜0.05);EG2、EG3组胆固醇含量显著降低(P＜0.05);3个试验组粗脂肪含量均显著降低(P＜0.05),系水力显著增高(P＜0.05),pH、粗灰分、粗蛋白质和氨基酸含量均无显著差异(P＞0.05);EG1、EG2和EG3组的棕榈油酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸等多不饱和脂肪酸均含量显著增加(P＜0.05);EG2和EG3组的Ca、Fe、Zn、Se含量也均有显著提高(P＜0.05)。背最长肌中,EG2、EG3组剪切力、pH、粗脂肪和胆固醇含量均显著降低(P＜0.05),EG2组粗灰分含量显著降低(P＜0.05);3个试验组系水力、粗蛋白质和氨基酸含量均无显著差异(P＞0.05);EG1、EG2和EG3组棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸等多不饱和脂肪酸含量,以及Ca和Zn含量均显著增加(P＜0.05);EG2和EG3组的Se含量显著增加,EG3组的Fe含量显著增加(P＜0.05)。③EG2、EG3组肠道胰蛋白酶和脂肪酶活力均显著升高(P＜0.05);肠道中总蛋白浓度均显著降低(P＜0.05)。④添加发酵杂交构树可显著提高试验羊肠道菌群的多样性和丰富度,肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)等益生菌的相对丰度提高,变形菌门(Proteobacteria)等有害菌的相对丰度降低。【结论】饲粮中添加24%~32%发酵杂交构树可以提高湖羊的肉品质、肠道消化酶活力,同时提高肠道菌群的丰富度和多样性,有利于动物机体对营养物质的吸收。

【目的】对中国不同地区各种饲料原料中矿物元素镁含量进行了调查研究,为饲粮中合理添加镁提供科学依据。【方法】从中国31个省、直辖市和自治区采集了37种4 054个主要畜禽饲料原料样品,经预处理后进行微波消解,采用离子色谱-电感耦合等离子体-质谱联用仪(IC-ICP-MS)测定其镁含量。并用SAS软件分别对同类不同种饲料样品和不同省(区)饲料样品的镁含量进行单因素方差分析,比较不同饲料原料中镁含量的差异及其在不同地区之间的差异。【结果】各类别饲料原料中镁含量分布规律为:矿物质饲料(平均镁含量为12 740 mg/kg)＞植物性蛋白质饲料(平均镁含量为4 335 mg/kg)＞谷类籽实加工副产品(平均镁含量为3 275 mg/kg)＞牧草类饲料(平均镁含量为2 482 mg/kg)＞秸秆类饲料(平均镁含量为2 346 mg/kg)＞动物性蛋白质饲料(平均镁含量为1 436 mg/kg)＞谷类籽实(平均镁含量为1 220 mg/kg)。同一类别的不同饲料原料中镁含量具有显著差异(P＜0.05)。谷类籽实中以小麦和大麦镁含量(1 358 mg/kg)为最高,稻谷镁含量(1 115 mg/kg)为最低;谷类籽实加工副产品中以米糠镁含量(5 791 mg/kg)为最高,碎米镁含量(387 mg/kg)为最低;植物性蛋白质饲料中以棉籽粕镁含量(6 664 mg/kg)为最高,膨化大豆镁含量(2 605 mg/kg)为最低;动物性蛋白质饲料中以鱼粉镁含量(3 479 mg/kg)为最高,血球蛋白粉镁含量(269 mg/kg)为最低;秸秆类饲料中以甘薯藤镁含量(4 024 mg/kg)为最高,小麦秸镁含量(1 136 mg/kg)为最低;牧草类饲料中以苜蓿镁含量(2 996 mg/kg)为最高,羊草镁含量(1 617 mg/kg)为最低;矿物质饲料中以磷酸氢钙镁含量(18 290 mg/kg)为最高,贝壳粉镁含量(3 118 mg/kg)为最低。以省(区)为单位,通过对不同省(区)玉米、小麦和豆粕的镁含量进行对比得知,不同省(区)同一种饲料原料中的镁含量存在显著差异(P＜0.05)。根据全国各地猪、鸡常用的152个饲料配方所计算出的基础饲粮中镁含量范围为1 848~2 100 mg/kg,如按中国猪、鸡饲养标准(2004)及美国NRC(1994)关于猪、鸡镁营养需要量的要求,则饲粮中约1/3的镁含量即可提供猪和鸡全部镁营养需要量,但上述估算尚未考虑不同饲料原料中镁的利用率。【结论】矿物元素镁含量在中国各地区、各种类饲料原料中存在较大差异,各地猪鸡常用饲料配方中的镁含量可满足猪鸡全部镁营养需要。因此,实际生产中要充分考虑到不同区域饲粮总镁含量及其利用率,在保证畜禽健康及高效生产的前提下减少镁的添加和资源的浪费。

【目的】通过研究蚯蚓液对105~175日龄蛋鸡产蛋性能、血清生化指标、抗氧化指标及免疫相关指标的影响,旨在为蚯蚓在畜牧业中的合理应用提供数据参考。【方法】选用720只105日龄健康、体重接近的海兰粉蛋鸡,随机分成4组,每组6个重复,每个重复30只,对照组提供基础饲粮,试验组提供分别添加1%、2%、3%蚯蚓液的基础饲粮。预试期15 d,正试期55 d。正试期内,按重复记录每天采食量、产蛋数和产蛋重;于正试期第55天,每个重复随机选取6枚鸡蛋进行蛋品质测定,每个重复随机选取6只蛋鸡采血,用于测定血清生化指标、抗氧化指标和免疫指标。【结果】与对照组相比,各试验组蛋鸡产蛋性能、蛋品质指标差异均不显著(P＞0.05)。1%、3%蚯蚓液组蛋鸡血清尿酸(UA)含量显著低于对照组(P＜0.05);总抗氧化能力(T-AOC)均极显著高于对照组(P＜0.01)。1%、2%、3%蚯蚓液组蛋鸡血清过氧化氢酶(CAT)和超氧化歧化酶(SOD)活性均极显著高于对照组(P＜0.01);丙二醛(MDA)、免疫球蛋白G(IgG)和白细胞介素2(IL-2)含量均显著低于对照组(P＜0.05)。1%、3%蚯蚓液组蛋鸡血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素17含量极显著低于对照组(P＜0.01)。【结论】蚯蚓液可以促进105~175日龄蛋鸡尿酸排泄,增强蛋鸡抗氧化能力和免疫能力,以1%添加量为宜。

【目的】研究TET(ten-eleven translocation)去甲基化酶对猪卵母细胞发育的影响。【方法】将收集的猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)置于不同浓度(0(对照组)、100、200和400 μmol/L)Bobcat339抑制剂的体外成熟培养液中培养42 h,测量卵丘扩展直径,统计成熟率,确定最小有效浓度。在体外成熟培养液中培养27 h后,利用免疫荧光(IF)检测5-甲基胞嘧啶(5mC)与5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)信号强度以及纺锤体组装情况;利用DCFH-DA染料检测卵母细胞活性氧(ROS)水平;利用JC-1染色法检测线粒体膜电位水平(MMP);利用ATP检测试剂检测卵母细胞ATP水平;利用实时荧光定量PCR检测42 h时COCs卵丘扩展相关基因表达水平和27 h时卵母细胞抗氧化相关基因表达水平。【结果】与对照组相比,100、200和400 μmol/L组卵丘细胞扩展水平均极显著降低(P＜0.01),100、200和400 μmol/L组成熟率显著或极显著降低(P＜0.05;P＜0.01),确定最小有效浓度为100 μmol/L,后续试验均用该浓度。IF检测结果显示,与对照组相比,27 h时100 μmol/L组卵母细胞中5mC信号强度显著升高(P＜0.05),而5hmC信号强度没有显著降低(P＞0.05)。与对照组相比,27 h时100 μmol/L组卵母细胞纺锤体排列紊乱,组装异常。与对照组相比,ROS水平极显著升高(P＜0.01),MMP和ATP水平极显著降低(P＜0.01)。与对照组相比,42 h时100 μmol/L组COCs中卵丘扩展相关基因透明质酸合成酶2(Has2)表达水平显著降低(P＜0.05),穿透素3(Ptx3)基因表达量极显著降低(P＜0.01),27 h时100 μmol/L组卵母细胞中抗氧化相关基因超氧化物歧化酶1(Sod1)与Sod2表达水平显著降低(P＜0.05)。【结论】TET去甲基化酶通过清除猪卵母细胞中的5mC,降低ROS水平,提高MMP水平来指导纺锤体正常组装排列,维持COCs的正常扩展,保证猪卵母细胞正常成熟。

【目的】探究苏紫猪白细胞抗原-1(swine leukocyte antigen-1,SLA-1)基因多态性,并对其抗病潜能进行分析,以期为苏紫猪分子育种提供理论基础。【方法】以苏紫猪血细胞cDNA为模板,用PCR法扩增苏紫猪SLA-1基因并测序,利用DNAStar和Mega 5.0软件分别进行相似性分析及系统进化树构建;利用NetMHCpan 4.1 server分析SLA-1与非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗原表位结合的能力及特征;运用生物学软件对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、结构和功能等进行预测。【结果】试验成功扩增6条苏紫猪SLA-1等位基因序列,分别为SLA-1*sz01、SLA-1*sz02、SLA-1*sz03、SLA-1*sz04、SLA-1*sz05和SLA-1*sz06,其高变异位点主要位于肽结合沟(peptide-binding groove,PBG)α1区和α2区;相似性比对结果显示,6条苏紫猪SLA-1等位基因核苷酸、氨基酸序列相似性分别在92.9%~96.9%、87.0%~94.8%之间,与不同品种猪核苷酸、氨基酸序列相似性分别在92.8%~98.8%、84.3%~98.0%之间;ASFV来源多肽结合能力的预测结果显示,SLA-1*sz01蛋白具有较强的ASFV抗原呈递能力,与ASFV来源B354L蛋白多肽片段FIDKTTVLY具有最高亲和力;SLA-1*sz01蛋白功能域及三级结构预测结果显示,SLA-1*sz01与免疫系统相关,具有经典的SLA-1三级结构。【结论】本研究扩增得到6条苏紫猪SLA-1基因序列,其中SLA-1*sz01能够限制性结合较多的ASFV来源抗原表位多肽,与多肽片段FIDKTTVLY具有最高亲和力,可作为苏紫猪抗病育种的候选基因。研究结果为ASFV疫苗的研发提供参考基础。

【目的】研究miR-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测miR-137-3p相对表达量;将miR-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴性对照(NC)分别转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,利用实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、C/EBPβ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)相对表达量,用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平;利用TargetScan在线网站预测miR-137-3p的靶基因,比对候选靶基因3'-UTR区与miR-137-3p结合位点在不同物种间的序列保守性。分别将miR-137-3p mimics、NC与3'-UTR-WT和3'-UTR-Mut载体共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验检测miR-137-3p与MYC相关因子X(MAX)基因的靶向关系。将siMAX、siNC转染3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和FABP4基因相对表达量,利用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平。【结果】在3T3-L1细胞的成脂分化过程中,与第0天相比,第2、4、6和8天miR-137-3p相对表达量均极显著降低(P＜0.01);与 NC组相比,miR-137-3p mimics组脂滴明显减少、变小,C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和FABP4基因相对表达量极显著或显著降低(P＜0.01;P＜0.05),C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达下调,miR-137-3p inhibitor组油红O观察结果、成脂分化标志基因mRNA和蛋白表达情况则与之相反。靶基因预测结果表明,MAX的3'-UTR区序列与miR-137-3p存在预测结合位点,且在不同物种间具有高度保守性。双荧光素酶报告试验显示,miR-137-3p mimics组3'-UTR-WT双荧光素酶活性极显著降低(P＜0.01);与NC组相比,mimics组MAX基因表达水平极显著降低(P＜0.01)、inhibitor组显著升高(P＜0.05)。与siNC组相比,敲低MAX基因表达,脂滴明显减少、变小,C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ和FABP4基因mRNA表达水平极显著下调(P＜0.01),C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达下降。【结论】内源性miR-137-3p在3T3-L1细胞的成脂分化过程中表达水平降低,miR-137-3p可能通过下调MAX基因的表达抑制3T3-L1细胞成脂分化。

【目的】探究不同品种、采精季节和采精月龄对法系公猪精液品质的影响,比较不同品种公猪精液的常温保存效果。【方法】选取278头法系杜洛克猪、长白猪和大白猪为试验对象,收集某种公猪站2021年17 960条精液记录数据,采用一般线性模型与方差分析探究品种、采精季节和采精月龄对精液体积、精液密度、精子活力及总精子数的影响;同时于夏季从各品种中分别选取15份精子活力≥90%、前向性运动≥80%精液,稀释后进行为期7 d的常温保存试验,比较不同品种公猪精液常温保存效果。【结果】长白猪精液体积、总精子数均显著高于杜洛克猪和大白猪(P＜0.05),杜洛克猪精液密度显著高于长白猪和大白猪(P＜0.05),精子活力显著低于长白猪和大白猪(P＜0.05)。随着常温保存时间的延长,各品种公猪精液精子活力和前向性运动逐渐降低,其中长白猪精液在夏季常温保存效果最好,杜洛克猪最差。各品种公猪精液体积在秋、冬季均显著高于春、夏季(P＜0.05),总精子数春、冬季均显著高于夏、秋季(P＜0.05),精液密度在春季显著高于其他季节(P＜0.05),各品种公猪精子活力均在冬季最高、夏季最低,且差异显著(P<0.05);不同季节长白猪精液体积、总精子数均显著高于杜洛克猪和大白猪(P＜0.05)。当采精月龄≤30时,公猪月龄越小精液体积越小,但精液密度偏高,精子活力相对较好,且公猪群体、长白猪和大白猪在19~24月龄、杜洛克猪在13~18月龄时总精子数均显著高于其他月龄(P＜0.05)。【结论】品种、采精季节和采精月龄均会影响公猪的精液品质,且不同品种公猪精液常温保存效果存在一定差异。研究结果可为公猪站制定生产计划提供参考,有助于公猪站进一步精细化管理,提高公猪利用率。

【目的】研究H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)广西毒株的遗传进化动态,以期掌握其地域流行新特点,为及时优化调整有效防控措施提供数据支持。【方法】采集2016－2021年广西各地的家禽喉头、泄殖腔及环境拭子样品3 600份,接种9~11日龄SPF鸡胚分离病毒,并结合血凝和血凝抑制试验及实时荧光定量RT-PCR方法鉴定AIV亚型,根据毒株检测年限和来源地选取部分H9亚型AIV核酸阳性样品进行HA、NA基因扩增、测序及进化动态分析。【结果】共获得46株H9亚型AIV广西毒株的HA、NA基因序列,其中HA基因全长1 683 bp,编码560个氨基酸;4株NA基因全长1 410 bp,编码469个氨基酸,42株缺失3个氨基酸,编码466个氨基酸。BLAST分析结果显示,越南及国内多个省份的毒株与本研究获得的广西毒株HA、NA基因相似性最高,分别为97.62%~99.88%和93.13%~99.79%,宿主源也不尽相同,表现遗传多样性特征。广西毒株之间HA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为93.0%~99.1%和94.6%~99.1%,NA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为83.9%~98.2%和86.1%~98.2%,表明HA基因较NA基因更为保守;与同期的参考毒株相似性高于早期,表明毒株存在持续进化。遗传进化分析结果显示,广西毒株的HA、NA基因属于当前优势流行的G57基因型分支,与疫苗株遗传关系较远。进化速率估算结果显示,HA、NA基因的平均进化速率分别为3.99×10^-3和4.59×10^-3替换/位点/年,最近共同祖先估算时间(tMRCA)分别为66.77和58.24年,表明HA基因比NA基因进化缓慢。重组分析结果显示,从鸡、鸭及环境中各分离到的毒株HA基因存在重组现象,主要亲本和次要亲本毒株均为人源的A/Beijing/1/2017株和禽源的A/quail/Hainan/250/2012株。【结论】当前H9亚型AIV广西流行毒株HA、NA基因与越南及国内省份的毒株相似性较高,具有遗传多样性特征,进化趋势以G57为优势基因型,与人源流感毒株发生基因重组,为新型流感产生创造条件。

【目的】分析猪源戊型肝炎病毒(Swine hepatitis E virus,sHEV)4型ORF2蛋白的结构和功能,筛选具有保护性抗原的基因片段并表达蛋白,为研究其作为潜在保护性抗原提供候选蛋白。【方法】对sHEV 4型ORF2蛋白进行生物信息学分析,选取具有潜在保护性抗原蛋白的基因片段ORF2(128/140),通过PCR扩增、酶切后克隆至昆虫细胞表达载体,转染sf9细胞,通过Western blotting鉴定分析表达蛋白p128/p140。【结果】生物信息学分析显示,sHEV 4型ORF2蛋白存在2个稳定蛋白:p128和p140,分别含有496和476个氨基酸,二者皆为稳定蛋白,无跨膜区,蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主。p128蛋白有11个T细胞表位、21个B细胞表位;p140蛋白有14个T细胞表位、18个B细胞表位。成功构建ORF2(128)、ORF2(140)2个基因的昆虫细胞表达载体,转染sf9细胞后经Western blotting检测发现,表达蛋白可被His标签单抗、sHEV抗体阳性血清识别。【结论】试验发现2个sHEV具有潜在保护性抗原的p128和p140蛋白,均可在sf9细胞中表达,且具有免疫活性。结果为进一步研究sHEV ORF2蛋白的功能和新型疫苗的研发提供了材料。

【目的】探讨禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜蛋白OmpA 对DF-1细胞自噬的影响,为研究OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用提供依据。【方法】以APEC E058 株基因组DNA为模版,通过PCR扩增回收ompA基因片段,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过酶切及测序鉴定筛选阳性的重组表达质粒pEGFP-N1-ompA;随后将质粒转染至鸡胚成纤维细胞DF-1并通过Western blotting和免疫荧光试验检测OmpA蛋白的表达情况;通过透射电子显微镜、免疫荧光试验及Western blotting方法检测OmpA对DF-1细胞自噬的影响。【结果】测序鉴定正确的重组质粒pEGFP-N1-ompA经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,获得大小分别为1 038和4 700 bp的条带,大小与载体和目的片段相符,表明真核表达质粒pEGFP-N1-ompA构建成功。将重组质粒经脂质体转染DF-1细胞后,通过免疫荧光试验可观察到大量绿色荧光,Western blotting检测到大小为65 ku的蛋白条带,表明成功转染pEGFP-N1-ompA至DF-1细胞中并大量表达ompA-EGFP融合蛋白。同时Western blotting结果显示,过表达OmpA可引起自噬标志性蛋白LC3 Ⅱ的表达量增加;通过透射电子显微镜可观察到DF-1细胞中的自噬小体。将单荧光GFP-LC3质粒转染DF-1细胞,OmpA蛋白处理组呈现绿色荧光点的聚集,说明OmpA引发DF-1细胞自噬。进一步研究发现,OmpA影响自噬标志蛋白p62降解,转染双荧光mRFP-GFP-LC3质粒检测显示OmpA可阻断自噬流的发生。【结论】APEC 外膜蛋白OmpA可引起DF-1细胞发生自噬,但其抑制自噬流的发生,引发DF-1细胞的不完全自噬,这将为进一步探讨APEC逃逸宿主细胞的清除作用提供参考。

【目的】研究Lm4b_02324基因编码的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶对单增李斯特菌生物学特性的影响,为研究单增李斯特菌的致病机制奠定基础。【方法】本研究使用重叠延伸PCR技术,并通过连续传代来构建稳定遗传野生型单增李斯特菌Lm928株的Lm4b_02324基因缺失株(Lm928Δm4b_02324)与Lm4b_02324基因回补株(CLm928Δm4b_02324)。通过检测不同培养时间的D_{600 nm}值并绘制生长曲线分析Lm928、Lm928ΔLm4b_02324和CLm928ΔLm4b_02324 3株菌的生长特性;对小鼠腹腔注射不同浓度的3株菌,观察感染后临床症状,统计死亡率,通过寇氏法计算3株菌对小鼠的半数致死量(LD₅₀);将Lm928、Lm928ΔLm4b_02324和CLm928ΔLm4b_02324以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10分别感染HCMEC细胞,通过检测感染后不同时间细胞内的细菌数量分析各菌株的黏附与侵袭能力和胞内生存能力;提取野生株与缺失株DNA,使用prfA、mpl、hly等9对毒力相关因子的引物,利用实时荧光定量PCR技术测定其表达情况。【结果】分别成功获得了大小为1 209 bp的基因缺失株Lm928ΔLm4b_02324(野生株:2 517 bp)和1 301 bp的回补株CLm928ΔLm4b_02324(野生株:1 301 bp,条带一致),且缺失株传至15代后未出现回复突变现象;生长曲线结果显示,野生株、缺失株和回补株的生长状况差异不显著(P＞0.05);LD₅₀测定结果显示,与野生型相比缺失株LD₅₀显著降低(P＜0.05);黏附与侵袭力试验结果显示,缺失株的胞内存活数显著或极显著高于野生株与回补株(P＜0.05; P＜0.01);感染HBMEC细胞12 h内,缺失株的胞内活菌数显著高于野生株 (P＜0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,Lm4b_02324 基因的缺失使得prfA、inlA、plcA基因表达显著降低(P＜0.05);hly、actA、mpl、inlC基因表达极显著降低(P＜0.01)。【结论】本研究结果表明,Lm4b_02324基因缺失会导致单增李斯特菌对小鼠的致死率升高并增强其在胞内增殖能力,为研究Lm4b_02324基因在单增李斯特菌致病中的作用奠定基础。

近年来随着抗生素在水产养殖业的滥用,导致细菌耐药性的产生,因此,需要绿色、安全、高效的新型策略来缓解耐药问题。群体感应作为一种通讯机制,根据细菌细胞间的密度来调节其行为和生理反应,其中许多活性物质能通过群体感应系统在不抑制病原菌生长的情况下影响病原菌的致病性,同时减缓耐药的产生。因此,近年来抑制细菌群体感应系统的抑制剂成为研究热点。嗜水气单胞菌作为水产养殖业中的主要条件病原菌,严重危害着水产养殖业的发展。笔者介绍了嗜水气单胞菌群体感应系统的作用机制,对细菌生物被膜的调节,以及群体感应系统抑制剂中草药和益生菌在防控嗜水气单胞菌中的应用,旨在分析嗜水气单胞菌群体感应抑制在未来的发展潜力,为水产养殖业中嗜水气单胞菌的防控提供一定的参考。

【目的】使用贝叶斯系统动力学方法重建猪繁殖与呼吸综合征病毒2型(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2,PRRSV-2)谱系8毒株在广东、广西、湖南、江西和福建5个省份间的传播及遗传演化规律,为猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的针对性防控提供参考。【方法】本研究对来自上述5省所有可用的PRRSV-2的ORF5序列进行系统发育分析,选取其中的谱系8毒株,剔除重组序列及可疑序列。将空间数据结合病原体的进化与流行病学特征进行分析,利用BEAST及相关软件计算病毒的共同祖先、核苷酸替代速率及不同地理位置间可能的传播方向和迁移速率等。【结果】系统发育分析显示,南方5省猪群中流行的PRRSV-2被分为4个谱系,其中154株被鉴定为谱系8毒株。在剔除1株重组毒株和3株可疑毒株后,来自上述5省的谱系8毒株ORF5序列具有强烈的时间信号,且最佳拟合模型为GTR＋I＋G。贝叶斯系统动力学分析表明,5省间谱系8毒株具有2.748×10^-3核苷酸替换/位点/年(95% HPD:2.053×10^-3~3.428×10^-3)的核苷酸替代速率,它们的最近共同祖先可能出现在2002年(95% HPD:1998-2005年)。据SPREAD3计算,广西的毒株向广东(Rate=0.876)、湖南(Rate=0.892)、江西(Rate=0.883)、福建(Rate=0.889)传播,以及部分福建毒株向广西(Rate=0.897)传播。【结论】自2005年以来,广东、广西、湖南、江西和福建5省猪群中流行的PRRSV-2具有丰富的遗传多样性,其中谱系8毒株具有较高的核苷酸替代速率,且有效种群大小在2006－2007年和2009－2013年明显上升。同时,广东、广西、湖南、江西和福建5省谱系8毒株的最近共同祖先可追溯至2002年,且以广西作为潜在发源地在该地区持续传播。

【目的】建立快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法。【方法】根据GenBank收录的ASFV分离株全基因组中的CP204L基因序列,在不影响氨基酸序列的前提下进行密码子优化,克隆到pCold TF冷休克表达载体,构建重组质粒pCold TF-p30。利用大肠杆菌原核表达系统进行IPTG诱导表达并对诱导时间和诱导浓度进行优化。用His标签镍柱对重组蛋白P30进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用纯化后的P30重组蛋白作为抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法并对反应条件进行优化,检验该方法的特异性、灵敏性和重复性,并用该方法与商品化试剂盒进行对比。【结果】重组质粒成功转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后以可溶性蛋白形式表达,在约82 ku处有目的蛋白特异性条带。当16 ℃诱导12 h时蛋白表达量最高,不同IPTG浓度诱导无明显差异。Western blotting结果显示,P30重组蛋白可与ASFV阳性血清产生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。建立的ASFV抗体间接ELISA检测方法抗原最佳包被浓度为1 μg/mL,使用1% BSA溶液封闭效果最佳,血清最佳稀释度为1∶600,酶标二抗最佳工作浓度为1∶8 000,该方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与商品化试剂盒总符合率达到96.7%。【结论】本试验成功表达并纯化了ASFV的P30蛋白,建立了ASFV抗体间接ELISA检测方法,为非洲猪瘟的监测、诊断及试剂盒开发提供了参考。

犬埃立克体(Ehrlichia canis,E.canis)引起的传染性疾病对犬或人类生命健康具有严重威胁,其可通过皮肤表面的伤口或节肢动物的叮咬侵入机体,进一步引起机体一系列反应,导致犬埃立克体相关疾病。此外,由犬埃立克体引起的疾病的临床症状与较多疾病的临床症状相似,在快速诊断上带来了一定程度的困难。犬埃立克体为严格的胞内寄生病原体,革兰氏染色为阴性,吉姆萨染色为紫色。目前已能成功分离该病原,并实现体外传代培养。犬埃立克体可诱导宿主细胞自噬,夺取宿主细胞的营养物质利于自身存活和增殖,并可诱导机体发生免疫反应,产生大量致炎因子,引起机体发热和对组织器官造成不同程度的损伤。犬埃立克体存在一种特殊的免疫逃避机制,能避免被宿主溶酶体或其他免疫因子清除,并在巨噬细胞内生长繁殖,破坏宿主细胞内的抗炎因子,进而破坏宿主的免疫功能。然而,犬埃立克体夺取或破坏宿主细胞营养成分或存活的具体机制尚不清楚,且如何逃避宿主免疫系统"追踪"有待研究。治疗方面,犬埃立克体仅对多西环素(doxycycline)等部分抗生素敏感,预防该病的最佳方法仍是定期清除体外寄生虫。笔者对犬埃立克体的病原特性、流行病学、致病机制等主要方面及部分病原与宿主细胞间作用的研究现状进行了综述。

【目的】通过噬菌体展示技术构建抗抑制素α亚基(INHα)纳米抗体文库,并筛选出针对绵羊INHα的特异性纳米抗体,以期制备出新型抑制素免疫制剂,为提高绵羊外周血促卵泡素(FSH)水平和排卵率做前期准备。【方法】利用pET32a-INHA原核表达载体诱导表达INHα蛋白,并对诱导表达的INHα蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;用Ni琼脂糖凝胶纯化后的INHα蛋白免疫新疆双峰驼。通过巢式PCR扩增制备骆驼噬菌体展示纳米抗体文库,通过三轮免疫亲和淘选及噬菌体ELISA从该文库中富集和筛选INHα特异性纳米抗体,并通过测序得知纳米抗体的基因序列;用蛋白-蛋白模拟对接初步鉴定该纳米抗体与INHα蛋白的亲和性。【结果】通过原核诱导表达及Ni琼脂糖凝胶纯化得到了大小为36 ku的INHα重组蛋白,通过Western blotting检测到约36 ku的蛋白条带;双峰驼通过6次INHα蛋白免疫抗体效价达到1∶1 024 000;通过巢式PCR获得了400 bp左右的VHH基因,通过电转化等试验构建了库容量为1.05×10¹²CFU的纳米抗体文库,文库阳性率为94%;通过三轮免疫亲和淘选获得3.0×10⁸ CFU的抗INHα纳米抗体文库,利用噬菌体ELISA获得了4株(VHH-4、VHH-29、VHH-89、VHH-108)INHα特异性纳米抗体,且4株INHα特异性纳米抗体基因序列相似度为80.31%;通过蛋白-蛋白模拟对接鉴定发现4株纳米抗体均与INHα具有较强的亲和性。此外,VHH-4与INHα的总自由能为-576.28 kJ/mol,是4种VHH中的最佳抗体。【结论】成功构建了抗INHα纳米抗体库,并从该库中获取了VHH-4、VHH-29、VHH-89和VHH-108 4株INHα特异性纳米抗体。本研究结果可为纳米抗体在生殖免疫学中的应用提供参考。

【目的】利用重组杆状病毒系统表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3) Cap重组鞭毛蛋白并研究该蛋白的反应原性和免疫原性,为开发PCV3亚单位疫苗提供数据支持。【方法】通过对Cap基因进行最适密码子优化并与鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因Flagellin进行融合后克隆到pFastBac^TM Ⅰ载体。通过Bac-to-Bac系统,筛选获得重组Cap-Flagellin杆状病毒,利用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blotting鉴定重组杆状病毒,将重组Cap-Flagellin杆状病毒免疫小鼠评价其免疫原性。【结果】重组Cap-Flagellin杆状病毒在Sf9细胞中能有效表达重组蛋白,SDS-PAGE检测可见68 ku的目的条带。IFA结果显示,重组Cap-Flagellin杆状病毒感染后72 h在Sf9细胞膜及胞浆中均出现绿色特异性荧光;Western blotting分析表明,重组蛋白能与PCV3阳性血清发生特异性反应,表明重组Cap-Flagellin蛋白具有良好的反应原性。小鼠免疫试验结果表明,与Cap杆状病毒组相比,重组Cap-Flagellin杆状病毒免疫小鼠2l和28 d后可诱导产生更高水平的Cap特异性抗体(P＜0.05;P<0.01),且Cap-Flagellin杆状病毒组小鼠脾细胞白细胞介素-8(IL-8)细胞因子水平显著或极显著高于其他组(P＜0.05;P＜0.01),表明重组Cap-Flagellin蛋白具有良好的免疫原性。【结论】本研究利用杆状病毒表达系统成功表达了PCV3 Cap重组鞭毛蛋白,并证实其具有良好的生物学活性,为PCV3亚单位疫苗的开发研制奠定了基础。

【目的】原核表达禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)Hexon蛋白,并制备兔抗Hexon多克隆抗体,为FAdV-4 Hexon功能研究提供材料。【方法】采用基于PCR的长DNA序列准确合成(PCR-based accurate synthesis,PSA)方法,设计全长拼接引物,在引物两端各设计保护性碱基合成FAdV-4 Hexon基因;利用同源重组技术将其连接至pCzn1-Hexon表达载体,获得pCzn1-Hexon重组质粒进行原核表达,采用纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。以间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】重组原核表达质粒pCzn1-Hexon经双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组蛋白以包涵体的形式表达,分子质量约为41 ku;用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔后,通过间接ELISA方法检测抗体效价高达1∶512 000。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting和IFA检测到鸡肝癌细胞(LMH)中的Hexon蛋白表达,表明制备的多克隆抗体能与Hexon蛋白发生特异性反应。【结论】FAdV-4 Hexon蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,制备并纯化的抗Hexon多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,该研究为进一步探究Hexon蛋白的生物学功能及其在FAdV-4感染和致病过程中的作用奠定了基础。

十二指肠贾第虫(又称肠贾第虫或蓝氏贾第虫)是一种常见的人兽共患寄生性原虫,寄生于人、家畜和犬猫等多种哺乳动物的小肠,由其导致的贾第虫病被世界卫生组织列为危害人类健康但被忽视的疾病之一。贾第虫生活史简单,由具有致病性滋养体和感染性包囊两个时期组成。在不良环境(胆固醇缺乏、碱性pH和高浓度胆汁条件等)刺激下,贾第虫滋养体会分化形成感染性包囊。形成包囊对贾第虫的生存、病原传播和致病至关重要。贾第虫感染往往是由于宿主吞食了感染性包囊污染的食物和饮水所致。包囊壁是贾第虫包囊抵抗外界不良环境、维持其生存能力和感染活性的重要屏障。包囊壁约40%由蛋白质组成,其余为N-乙酰半乳糖胺等碳水化合物和脂类等。贾第虫包囊壁主要含3种囊壁蛋白(cyst wall protein,CWP):CWP1、CWP2和CWP3。囊壁蛋白不仅在维持包囊活力方面发挥重要作用,且在贾第虫病诊断、口服疫苗开发等方面具有重要价值。笔者综述了贾第虫包囊壁的组成和形成、包囊成囊的诱导及调节、囊壁蛋白在疾病诊断和疫苗方面的研究,以期为后续相关研究提供参考。

【目的】研究A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)感染对黄羽肉鸡肠道氧化应激和炎症反应的影响及初步机制,为产气荚膜梭菌致病机制的研究和防控药物的开发提供理论依据。【方法】将100羽1日龄健康黄羽肉鸡随机分为4组,即对照组和高、中、低剂量感染组,每组5个重复,每个重复5羽。试验全期,各组肉鸡饲喂基础饲粮,于14~16日龄,对照组肉鸡灌服PBS,高、中、低剂量感染组肉鸡分别灌服1×10⁹、1×10⁸和1×10⁷ CFU产气荚膜梭菌,连续灌服3 d。测定感染1和3 d的肉鸡血液生化指标、空肠和回肠氧化应激和炎症相关因子水平,观察空肠和回肠组织病理损伤。【结果】与对照组相比,不同剂量感染组肉鸡的炎性相关因子和氧化应激指标呈不同程度变化,其中高剂量组感染1 d显著提高了肉鸡血清碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,以及空肠丙二醛(MDA)含量、空肠和回肠白细胞介素8(IL-8)水平(P＜0.05),并降低了空肠和回肠超氧化物歧化酶(SOD)活性、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)含量、空肠白细胞介素10(IL-10)含量(P＜0.05);高剂量组感染3 d肉鸡血清AKP、ACP和LDH酶活性显著升高(P＜0.05),空肠MDA、谷胱甘肽(GSH)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、MCP-1、IL-10、半胱氨酸蛋白酶(caspase-1)的含量及caspase-1、IL-1β和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)mRNA相对表达量显著或极显著升高(P＜0.05;P＜0.01),回肠MDA、GSH、TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-8和IL-10含量及caspase-1、IL-1β、NLRP3和Gasdermin A 的mRNA相对表达量显著或极显著升高(P＜0.05;P＜0.01)。中剂量组感染1 d显著提高了肉鸡血清中AKP酶活性和显著降低了空肠SOD酶活性(P＜0.05),感染3 d显著提高血清中ACP和AKP酶活性(P＜0.05)和回肠GSH含量(P＜0.05)。低剂量组感染1和3 d显著提高血清中ACP和AKP酶活性(P＜0.05),感染1 d能显著降低空肠SOD酶活性和IL-18含量(P＜0.05)。高剂量组肉鸡空肠和回肠黏膜出血,肠黏膜上皮细胞坏死脱落,炎性细胞浸润。中剂量组和低剂量组的空肠和回肠肠绒毛有轻微断裂,对照组的空肠和回肠组织结构正常。【结论】1×10⁹ CFU产气荚膜梭菌连续3 d感染14日龄黄羽肉鸡,可能通过过度激活NLRP3炎性小体信号通路,提高雏鸡空肠和回肠组织炎性因子的表达水平、降低雏鸡的抗氧化能力、破坏空肠和回肠肠道组织结构,诱发鸡坏死性肠炎。

【目的】探究5株自筛解淀粉芽孢杆菌(YN-BA1、YN-BA2、YN-BA3、YN-BA4、YN-BA5)的生长曲线、pH和胆盐耐受性、抑菌活性和抗生素敏感性等特性,为将其开发成微生态制剂应用于养殖中提供理论依据。【方法】采用比浊法测定解淀粉芽孢杆菌生长曲线,将5株解淀粉芽孢杆菌分别接种于经盐酸配制成pH为2.0、3.0、4.0和7.0的LB肉汤中培养2 h和0.3%胆盐环境中培养5 h,以评价其在人工胃肠液中的耐受性;采用琼脂打孔法测定体外抑菌活性,采用KB纸片法测定抗生素敏感性。【结果】5株解淀粉芽孢杆菌在经过0~2 h的缓慢生长和6~8 h生长速度降低后,其生长量快速上升,进入对数生长期;36 h后生长量下降,进入衰退期。5株解淀粉芽孢杆菌均具有不同的耐酸、耐胆盐能力,其中YN-BA2菌株在pH 2.0、3.0、4.0存活率分别为42.10%、51.50%和74.67%,均高于另外4株菌;在0.3%胆盐处理5 h后,YN-BA2菌株存活率为51.00%,高于另外4株菌,表明YN-BA2菌株的耐受力最高。5株解淀粉芽孢杆菌对肠炎沙门氏菌(YN-S1、YN-S2)、鸡白痢沙门菌(YN-SP9、YN-SP10)、大肠杆菌DO157均有抑菌作用,YN-BA2菌株对鸡白痢沙门氏菌YN-SP10具有高敏感性,其余4株解淀粉芽孢杆菌对实验室保存的肠道致病菌均为中敏,表明YN-BA2菌株抑菌效果最好。5株解淀粉芽孢杆菌对四环素(除YN-BA5外)、诺氟沙星有耐药性,对链霉素、青霉素G、头孢氨苄有不同程度的耐药性,对红霉素、卡那霉素(除YN-BA5外)、左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、阿奇霉素(除YN-BA1外)、氨苄西林、林可霉素敏感。【结论】解淀粉芽孢杆菌能够快速活化,对胆盐及pH的耐受性良好,对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等具有一定的抑制作用,对四环素、诺氟沙星耐药。因此,解淀粉芽孢杆菌具有开发为微生态制剂的潜能,以用于畜禽养殖生产。

【目的】探究中药方剂与复合益生菌联合应用预防柔嫩艾美耳球虫病的作用效果。【方法】试验选择180只12日龄贵农金黄鸡,分成空白对照组、感染组、中药组、益生菌组、中药+益生菌组和莫能菌素组,每组3个重复,每个重复10只鸡。空白对照组和感染组空腹灌服生理盐水(200 μL/只),中药组在基础饲粮中添加2%中药方剂,益生菌组空腹灌服复合益生菌(200 μL/只),中药＋益生菌组空腹灌服复合益生菌(200 μL/只)＋基础饲粮添加2%中药方剂,莫能菌素组在基础饲粮中添加100 mg/kg莫能菌素。14日龄时,除空白对照组外其余各组经口灌服1×10⁵个/只柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊悬液。接种球虫和剖杀前称重并统计相对增重率和存活率;感染0、4和8 d采集血液,用ELASA法检测血清生化、免疫和抗氧化指标;试验结束后采集盲肠组织并观察组织病理学变化。【结果】各预防给药组相对增重率均高于感染组,盲肠每克卵囊数均显著低于感染组(P<0.05),其中中药+益生菌组相对增重率最高、盲肠每克卵囊数最低,抗球虫指数(anticoccidial index,ACI)超过莫能菌素组。与感染组相比,感染4 d,中药组、益生菌组和中药＋益生菌组血清白蛋白(ALB)和甘油三酯(TG)含量均显著升高(P＜0.05),肌酐(CREA)含量显著降低(P＜0.05);中药组和中药＋益生菌组血清总蛋白(TP)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-6和γ-干扰素(IFN-γ)含量显著升高(P＜0.05),谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性均显著下降(P＜0.05)。感染8 d,中药组、益生菌组和中药＋益生菌组血清TP、ALB含量均显著升高(P＜0.05),尿素氮(BUN)含量和AST活性均显著降低(P＜0.05);中药组和中药＋益生菌组TG、IL-2、IL-6和IFN-γ含量均显著升高(P＜0.05),CREA含量和ALT活性均显著下降(P＜0.05)。盲肠组织病理学结果显示,感染组和益生菌组有明显病理损伤,中药组和中药＋益生菌组组织损伤较轻微。【结论】中药和益生菌联合使用能改善因柔嫩艾美耳球虫感染引起的生长抑制,降低卵囊排出量,提高机体免疫力和抗氧化能力,缓解鸡球虫感染引起的组织损伤,研究结果为鸡球虫病的防治提供参考。

【目的】运用网络药理学、分子对接和动力学模拟技术研究益母草碱治疗肠道炎症的分子机制。【方法】采用Pubchem、PharmMapper和SwissTargetPrediction数据库收集益母草碱与肠道炎症的潜在靶点,利用Venny 2.1在线作图工具平台系统获取益母草碱治疗肠道炎症的交集靶点;通过STRING与DAVID数据库获取蛋白-蛋白相互作用(PPI)关系并绘制交集靶点的PPI网络图,对交集靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析,运用Cytoscape 3.8.2软件筛选得到核心靶点蛋白,应用分子对接技术与分子动力学模拟对核心靶点进行验证。【结果】共收集到379个与益母草碱相关的潜在靶点蛋白,15 464个与肠道炎症相关的潜在靶点,获得170个益母草碱治疗肠道炎症的潜在交集靶点,筛选出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、抑癌基因TP53、前列腺素氧化环化酶2(PTGS2)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、多聚ADP核糖聚合酶1(PARP1)等16个核心靶点。GO功能及 KEGG通路富集分析结果显示,益母草碱通过调控蛋白质磷酸化、细胞增殖、凋亡过程负调控、蛋白水解、炎症反应等144个生物过程和Fc epsilon RI信号通路、Fc γ-R介导的吞噬作用、MAPK信号通路、mTOR 信号通路等55条信号通路治疗肠道炎症。分子对接结果表明,益母草碱与核心靶点中PTGS2、mTOR、PARP1对接结果良好,有较强的结合活性,分子动力学模拟发现益母草碱与3个蛋白之间主要以氢键和疏水键相结合。【结论】益母草碱通过mTOR、PARP1、PTGS2等多个靶点,多个信号通路、多途径发挥其对肠道炎症的治疗效果。本研究结果为益母草碱在临床中的应用奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的烈性、高度接触性传染病,主要引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状。疫苗免疫是防控PRRS的主要手段,但由于PRRSV毒株高度变异性导致疫苗对该病的效果仍不理想。中药(traditional Chinese medicine,TCM)活性成分众多,生理活性多样,包括抗菌、抗病毒和抗氧化等作用,是抗病毒药物的研究热点。研究证明,中药能以单体或复方的方式对PRRSV产生抑制增殖、阻断吸附和杀灭病毒的作用,以及对机体免疫反应产生影响。关于中药抗PRRSV的机制包括直接抗病毒机制和间接抗病毒机制。直接抗病毒机制即中药有效成分对病毒复制周期的直接影响,主要表现为抑制病毒的吸附、内化、复制、大分子组装和释放中的一环,从而达到抑制病毒的作用。间接抗病毒机制即中药有效成分通过调节细胞因子合成、炎症信号通路、细胞凋亡、氧化代谢和免疫系统等途径来抑制病毒对宿主细胞的负面影响,保证机体免疫反应产生的同时减少机体的损伤。由于中药成分复杂,且抗PRRSV机制尚不明确,因此,笔者以抗病毒作用机制为依据对近年来中药抗PRRSV的研究进行综述,以期为中药防控PRRSV提供理论依据。

【目的】运用三维重建和3D打印技术构建比格犬的肝脏三维模型,为犬的肝脏疾病诊疗和相关手术提供三维数据和形态学依据,同时为实验动物的减量使用及提升动物福利奠定基础。【方法】选取1只8月龄、体重14.5 kg的健康雌性比格犬,全身麻醉后静脉注射碘海醇,通过128层螺旋电子计算机断层扫描(computed tomography,CT)对犬的肝脏进行二维图像数据采集,随后利用IPS软件进行数字化分割和三维重建,并使用Touch Viewer软件对图像进行测量。将重建数据传送至3D打印机,逐个生成门静脉、肝静脉、肝动脉等组织的3D打印模型,经上色、图层优化和拼装处理后,最终获得犬的肝脏3D物理模型。【结果】运用CT增强造影数据构建的肝脏三维重建模型形态逼真、立体感强,可在三维空间内进行任意缩放、角度旋转,并可通过调整阈值进行平面映射,形成各部位的切面或单独显示肝动脉、肝静脉、门静脉以及胆管的走向与分布,便于观察各脉管结构的空间位置,展示复杂的肝脏局部解剖结构。Touch Viewer测量结果显示,肝脏体积为556.14 mL,表面积为600.85 cm²,胆囊体积为12.67 mL,表面积为32.47 cm²。3D打印模型显示各组织血管分布清晰、颜色鲜艳,与数字化三维模型基本一致,获得了较为真实且理想的肝脏模型。【结论】利用三维重建和3D打印技术可成功构建犬的肝脏模型,能直观展示复杂的肝脏三维形态和空间结构,可作为数字化、精准化宠物医疗及兽医解剖学、影像学教学的良好模拟平台和实践工具。

【目的】基于网络药理学技术探究复合植物精油(牛至精油、肉桂醛、桉叶油)的药理活性及整体作用机制。【方法】利用中药系统药理学分析数据库(TCMSP)获得复合植物精油活性成分的潜在作用靶点,利用Cytoscape 3.7.1软件构建成分-靶点网络图,通过STRING平台构建蛋白相互作用(PPI)网络图并进行可视化分析,使用DAVID数据库对靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,并利用AutoDock Vina软件对主要活性成分和关键靶点进行分子对接分析。【结果】复合植物精油的8个活性成分可作用于白细胞介素6(interleukin 6,IL6)、人前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)、转录因子p65(transcription factor p65,RELA)、内皮型一氧化氮合酶(nitric-oxide synthase,endothelial,NOS3)、芳香烃受体蛋白(aryl hydrocarbon receptor,AHR)、细胞色素P450 1A1(cytochrome P450 1A1,CYP1A1)、人NF-κB抑制剂(NF-kappa-B inhibitor alpha,NFKBIA)、γ-氨基丁酸受体亚基α-2(gamma-aminobutyric-acid receptor alpha-2 subunit,GABRA2)等关键靶点。GO功能富集分析显示,共获得269个条目,其中与生物过程相关的条目181个,涉及腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、突触后膜电位调节等;与细胞组分相关的条目29个,涉及质膜的组成、神经元投射等;与分子功能相关的条目59个,涉及激活神经递质受体活性、调节细胞外配体门控离子通道活性等。共有KEGG信号通路72条,主要参与调控神经活性配体-受体相互作用、脂质和动脉粥样硬化、cGMP-PKG信号通路、钙信号通路、TLR信号通路、Th17细胞分化等信号通路,同时与酒精性肝病、卡波西肉瘤相关性疱疹病毒感染等疾病相关。分子对接结果显示,丁香酚、石竹烯、百里香酚与IL6、PTGS2结合紧密,亲和力较好。【结论】复合植物精油可通过丁香酚、石竹烯、百里香酚、D-柠檬烯、肉桂醛等多种活性成分作用于IL6、PTGS2、TLR4、RELA等靶点上,参与调控神经、免疫调节、抑菌、抗炎和抗肿瘤等相关信号通路,具有多成分、多靶点、多通路的作用机制。

【目的】探究益母草碱对脂多糖(LPS)诱导小鼠子宫内膜炎的抗炎作用。【方法】将60只6~8周龄雌性C57小鼠随机分为6组:空白对照组,模型组,益母草碱低、中、高剂量组及地塞米松阳性对照组,每组10只。空白对照组经阴道灌注50 μL PBS缓冲液,其余组经阴道灌注50 μL LPS(1 mg/mL)建立小鼠子宫内膜炎疾病模型。造模后,益母草碱低、中、高剂量组分别腹腔注射7.5、15.0、30.0 mg/kg益母草碱,阳性对照组腹腔注射5.0 mg/kg地塞米松,每6 h 1次,连续3次。造模24 h后处死小鼠,测定各组小鼠子宫指数;通过HE染色观察子宫组织病理变化;采用ELISA法检测子宫组织白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等相关炎症因子含量及髓过氧化物酶(MPO)活性。【结果】与空白对照组相比,模型组小鼠子宫指数、子宫组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量与MPO活性均极显著升高(P＜0.01);与模型组相比,不同剂量益母草碱能不同程度降低LPS诱导子宫内膜炎小鼠的子宫指数、子宫组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量与MPO活性(P<0.01),并呈剂量依赖性;与模型组相比,阳性对照组小鼠子宫指数、子宫组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量与MPO活性极显著降低(P＜0.01)。【结论】益母草碱可降低LPS诱导子宫内膜炎小鼠子宫指数、TNF-α、IL-1β、IL-6炎性因子含量及MPO活性,减轻炎症症状,显示出良好的抗炎效果。

【目的】调查规模化舍饲羊场及散养羊消化道感染及环境污染寄生虫情况,为中国规模舍饲羊场羊消化道寄生虫综合防控提供参考。【方法】采用离心沉淀法、卢戈氏碘液染色法和饱和蔗糖溶液漂浮法等技术,对采自河南和宁夏的4个规模舍饲羊场及12个散养户的1 025份羊粪便样品寄生虫感染和712份环境样品寄生虫污染情况进行检查,采用麦克马斯特法计数球虫阳性样品每克粪便中的球虫卵囊数(OPG)。选择汝州规模舍饲羊场进行季节动态调查,了解不同季节规模舍饲羊场羊消化道感染及环境污染寄生虫情况。【结果】羊消化道寄生虫总感染率为82.83%(849/1 025),共检出8种(类)寄生虫,分别为球虫、阿米巴、贾第虫、隐孢子虫、绦虫、鞭虫、细颈线虫和其他线虫。优势虫种为球虫(71.90%),其次为阿米巴(49.07%),球虫与阿米巴较易发生混合感染。环境样品寄生虫总阳性率为38.48%(274/712),共检出6种(类)寄生虫,包括球虫、阿米巴、贾第虫、鞭虫、细颈线虫和其他线虫,优势虫种是线虫(22.75%)。河南规模舍饲羊场羊消化道寄生虫感染率以及环境样品寄生虫检出率均显著低于宁夏规模舍饲羊场(P＜0.05)。舍饲羊与散养放牧羊相比,感染的虫种更少、感染率更低;哺乳羔羊消化道寄生虫感染率显著低于其他生理阶段(P＜0.05);在汝州规模舍饲羊场中,冬季羊消化道寄生虫感染率显著低于其他季节(P＜0.05),哺乳羔羊球虫感染率最低(14.95%),但感染强度最大(平均OPG为105 203);育肥期羔羊的感染率最高(88.99%)。【结论】规模化舍饲羊场羊消化道寄生虫感染率较高,球虫和阿米巴混合感染较普遍,环境寄生虫污染严重,应加强卫生措施,防止环境寄生虫污染及病原散播,做好计划性驱虫。

堆肥技术是鸡粪无害化处理的重要途径,但堆肥过程中产生的废气对堆肥质量产生不利影响,对生态环境与人类健康造成危害,因此对鸡粪堆肥时产生的废气的控制技术是堆肥技术发展的限制性因素之一。这些废气通常组分复杂,气味较重,其中含有氮和硫两种元素的废气是重点研究对象,包括有氨、氮氧化物、硫化氢,以及含氮和含硫的醇类、酮类、醚类等气态挥发性有机化合物,文章介绍了这些废气中主要成分的产生机理,简述了其排放强度的规律与鸡粪性质、堆肥环境及工艺条件相关参数的关系,从优化堆肥工艺条件(温度、含氧量、pH、碳氮比和含水量),采用生物法(添加微生物菌剂、生物过滤法和生物联合堆肥)、调节剂法(添加生物炭和其他添加剂)和末端技术等方面降低或去除堆肥过程中废气的排放,回顾了国内外学者们近年在此方面的研究成果,分析了各方法对不同废气的去除效果和实际应用中的问题,探讨了其未来在生产实践中应用的前景,以期为鸡粪及其他废物堆肥过程中的废气控制研究提供参考。