禽流感病毒通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR 检测方法研究

›› 2012, Vol. 39 ›› Issue (3): 165-171.

禽流感病毒通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR 检测方法研究

杨素¹, 廖秀云¹, 廖明², 沙才华¹, 徐海聂¹, 曹伟胜², 陈伟生¹

1. 珠海出入境检验检疫局,广东珠海 519015;2. 华南农业大学,广东广州 510642

收稿日期:1900-01-01 修回日期:2011-08-25 出版日期:2012-03-20 发布日期:2012-03-20

Development of Nested Real-time RT-PCR for Detection of Influenza A Viruse and Subtype H5

YANG Su¹, LIAO Xiu-yun¹, LIAO Ming², SHA Cai-hua¹, XU Hai-nie¹, CAO Wei-sheng², CHEN Wei-sheng ¹

1. Zhuhai Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau,Zhuhai 519015,China;2. South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China

Received:1900-01-01 Revised:2011-08-25 Online:2012-03-20 Published:2012-03-20

摘要/Abstract

摘要： 将套式PCR与荧光RT-PCR技术相结合,叠加这两种技术在敏感性和特异性方面的优势,建立敏感性高于常规荧光RT-PCR的套式荧光RT-PCR检测方法。从GenBank下载禽流感病毒NP基因和HA基因序列,通过比对选取较为保守的片段,设计AIV通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR引物和TaqMan探针;利用体外转录技术制备阳性对照,构建目的片段重组质粒;经反应体系和反应条件的优化,建立套式荧光RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法可特异性地检测禽流感病毒及H5亚型AIV,在30份鱼类养殖水样中检测到19份阳性样品,具有较高的敏感性和良好的特异性;具有高通量、快速的特点,可对大批量样品同时进行检测,试验耗时仅需5 h,是自然环境样品中极微量禽流感病毒检测的好方法。

关键词: 禽流感病毒; 通用型; H5亚型; 套式荧光RT-PCR; 检测方法

Abstract: Combining nested PCR (NP-PCR) with real-time RT-PCR,superimposing advantages of sensitivity and specificity of these two methods,establwhed nested real-time RT-PCR for detecting AIV and subtype H5,which was more sensitive than conventional real-time RT-PCR. Basing on the conserved AIV NP and HA gene downloaded from GenBank,designed nested real-time RT-PCR primers and TaqMan probes for detecting AIV and subtype H5. Target segments recombined plasmids were constructed,and positive controls were prepared with technology of in vitro transcription.Nested real-time RT-PCR was established after reaction mixtures and condition screened out. Test results indicated that this established method can specific detect AIV and H5 subtype,19 of 30 fish aquaculture water samples were presented positive results,multitudinous samples can be detected simultaneously within 5 h. It is a good method for detecting trace AIV from samples of the natural environment,with distinguishing feature of high sensitivity,good specificity,high throughout and rapidity.

Key words: influenza A viruse; general type subtype H5; nested real-time RT-PCR; detection method

中图分类号:

S852.65

杨素;廖秀云;廖明;沙才华;徐海聂;曹伟胜;陈伟生. 禽流感病毒通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR 检测方法研究[J]. , 2012, 39(3): 165-171.

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