GDF9慢病毒载体的构建及其在山羊原代成纤维细胞中的稳定表达

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.09.004

《中国畜牧兽医》 ›› 2017, Vol. 44 ›› Issue (9): 2566-2572.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.09.004

GDF9慢病毒载体的构建及其在山羊原代成纤维细胞中的稳定表达

滑留帅, 王璟, 陈付英, 辛晓玲, 楚秋霞, 冯亚杰, 徐照学, 王二耀

河南省农业科学院畜牧兽医研究所, 河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室, 郑州 450002

收稿日期:2017-03-07 出版日期:2017-09-20 发布日期:2017-09-22
通讯作者: 王二耀 E-mail:wangeryao666@qq.com
作者简介:滑留帅(1982-),男,河南偃师人,博士,助理研究员,研究方向:动物遗传育种与繁殖,E-mail:hualiushuai@qq.com
基金资助:
转基因生物新品种培育子课题——优质转基因（fat-1）肉山羊新品种培育（2014ZX08008003-007）；家畜"卵泡波"对外源激素的响应机制研究（162102110035）；羊促卵泡素（FSH）敏感性的分子调控机制研究（2016YQ18）

Construction of GDF9 Lentiviral Vector and Its Stable Expression in Goat Primary Fibroblasts

HUA Liu-shuai, WANG Jing, CHEN Fu-ying, XIN Xiao-ling, CHU Qiu-xia, FENG Ya-jie, XU Zhao-xue, WANG Er-yao

Henan Key Laboratory of Farm Animal Breeding and Nutritional Regulation, Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China

Received:2017-03-07 Online:2017-09-20 Published:2017-09-22

摘要/Abstract

摘要：

试验旨在构建山羊生长分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）慢病毒载体，并使其在山羊原代成纤维细胞中稳定表达。利用全基因合成法克隆了绵羊GDF9基因的CDS全长片段，长约1 362 bp，编码453个氨基酸。利用双酶切和连接，将GDF9基因片段亚克隆至慢病毒载体中，构建了过表达GDF9的慢病毒载体。将慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞后，获得了滴度为1×10⁶ TU/mL的慢病毒。利用制备的GDF9慢病毒感染山羊原代成纤维细胞后，观察荧光表明，60%以上的细胞能够观察到红色荧光，说明制备的慢病毒对山羊原代成纤维细胞具有较高的感染效率。经过嘌呤霉素筛选后，所有的细胞均能观察到红色荧光。实时荧光定量PCR分析表明，制备的细胞系中GDF9表达水平比对照组高12.17倍，说明成功获得了稳定表达GDF9的山羊成纤维细胞系。本试验结果为进一步研究GDF9基因的生物学功能，以及山羊未来的种质资源创新奠定基础。

关键词: GDF9基因; 慢病毒; 山羊; 原代成纤维细胞

Abstract:

This study was aimed to constract growth differentiation factor 9 (GDF9) lentiviral vector,which was stably expressed in goat primary fibroblast. The CDS of sheep GDF9 gene was cloned by gene synthesis, the CDS was 1 362 bp, encoding 453 amino acids. After double enzyme digestion and ligation, the GDF9 fragment was sub-cloned into an empty lentiviral vector. The GDF9 lentiviral vector and the packaging plasmids were co-transfected into 293T cells, and the lentivirus with titer of 1×10⁶ TU/mL was obtained. The goat primary fibroblasts were transfected with GDF9 lentivirus, the red fluorescence could be observed in more than 60% of the cells, suggesting the prepared lentivirus had high infection efficiency to goat primary fibroblasts. After puromycin screening, all cells were able to observe red fluorescence. Real-time quantitative PCR analysis showed that the GDF9 expression level was higher than that of control group. The results indicated that the goat primary fibroblasts stably expressing GDF9 were successfully obtained. This results might lay a foundation for the function study of GDF9 and the goat germplasm resources innovation in the future.

Key words: GDF9 gene; lentivirus; goat; primary fibroblasts

中图分类号:

Q782

滑留帅, 王璟, 陈付英, 辛晓玲, 楚秋霞, 冯亚杰, 徐照学, 王二耀. GDF9慢病毒载体的构建及其在山羊原代成纤维细胞中的稳定表达[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(9): 2566-2572.

HUA Liu-shuai, WANG Jing, CHEN Fu-ying, XIN Xiao-ling, CHU Qiu-xia, FENG Ya-jie, XU Zhao-xue, WANG Er-yao. Construction of GDF9 Lentiviral Vector and Its Stable Expression in Goat Primary Fibroblasts[J]. , 2017, 44(9): 2566-2572.

参考文献

[1] 郑钰, 赵杰, 李宁. 转基因动物技术及其应用进展[J]. 生物产业技术, 2014, 1(1):7-16.
[2] 周扬, 张钦恺, 潘庆杰. 转基因动物的相关研究进展[J]. 黑龙江动物繁殖, 2013, 21(6):3-9.
[3] 徐睿瑶, 蔡洁行, 张玉彬. 生产用重组哺乳动物细胞株的克隆筛选方法[J]. 中国细胞生物学学报, 2015, 37(5):746-752.
[4] 李晓玲, 于光辉, 孙金海. 转双基因(pGH/IGF-Ⅰ)猪胎儿成纤维细胞系的建立及鉴定[J]. 中国畜牧兽医, 2016, 43(8):2053-2059.
[5] 欧阳曼, 王海龙, 赵影, 等. 过表达FGFR2重组HEK293细胞株的构建和鉴定[J]. 中国医药工业杂志, 2017, 48(1):38-42.
[6] 龚国春, 戴蕴平, 樊宝良, 等. 以不同类型的转基因细胞为核供体生产牛的转基因克隆胚胎[J]. 中国科学C辑(生命科学), 2003, 33(6):532-538.
[7] Abdel-Ghani M A, El-Sherry T M, Abdelhafeez H H. Effect of growth differentiation factor-9(GDF-9) on the progression of buffalo follicles in vitrified-warmed ovarian tissues[J]. Reprod Domest Anim, 2016, 51(5):795-803.
[8] Fernandez T, Palomino J, Parraguez V H, et al. Differential expression of GDF-9 and BMP-15 during follicular development in canine ovaries evaluated by flow cytometry[J]. Anim Reprod Sci, 2016, 167:59-67.
[9] Bravo S, Larama G, Paz E, et al. Polymorphism of the GDF 9 gene associated with litter size in Araucana Creole sheep[J]. Anim Genet, 2016, 47(3):390-391.
[10] Serdynska-Szuster M, Jedrzejczak P, Ozegowska K E, et al. Effect of growth differentiation factor 9 C447T and G546A polymorphisms on the outcomes of in vitro fertilization[J]. Mol Med Rep, 2016, 13(5):4437-4442.
[11] Qin N, Liu Q, Zhang Y Y, et al. Association of novel polymorphisms of forkhead box L2 and growth differentiation factor-9 genes with egg production traits in local Chinese Dagu hens[J]. Poult Sci, 2015, 94(1):88-95.
[12] 楚秋霞, 王二耀, 吴姣, 等. 绿色荧光蛋白基因在山羊胎儿成纤维细胞中的表达[J]. 河南农业科学, 2013, 42(10):142-145.
[13] Mandon-Pépin B, Oustry-Vaiman A, Vigier B, et al. Expression profiles and chromosomal localization of genes controlling meiosis and follicular development in the sheep ovary[J]. Biol Reprod, 2003, 68(3):985-995.
[14] 郑爱燕, 吴曼, 尚利青, 等. 山羊GDF 9基因在卵丘卵母细胞复合体体外成熟过程中的表达[J]. 畜牧兽医学报, 2010, 41(6):671-677.
[15] 徐敏丽, 白莉雅, 王建英, 等. 绵羊GDF 9基因研究进展[J]. 山东农业科学, 2016, 48(5):148-152.
[16] 汤继顺, 惠文巧, 朱德建, 等. 母羊多胎性候选基因GDF 9的研究进展[J]. 畜牧与饲料科学, 2016, 37(Z1):40-42.
[17] 董传河, 杜立新. 山羊GDF 9基因多态性与产羔数关联分析研究[J]. 山东农业大学学报(自然科学版), 2011, 42(2):227-237.
[18] Shi F T, Cheung A P, Huang H F, et al. Growth differentiation factor 9(GDF9) suppresses follistatin and follistatin-like 3 production in human granulosa-lutein cells[J]. PLoS On e, 2011, 6(8):e22866.
[19] Dong J W, Albertini D F, Nishimori K, et al. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis[J]. Nature, 1996, 383(6600):531-535.
[20] 李碧侠, 储明星, 王金玉. 生长分化因子9基因的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2002, 29(6):33-36.
[21] 彭中友, 孙俊铭, 李燕, 等. GDF9和FST调控猪卵母细胞成熟和胚胎早期发育[J]. 江苏农业学报, 2015, 31(3):583-589.
[22] 刘霜, 郑杰, 卢建远, 等. 山羊卵巢中BMP 15、GDF 9和BMPR 1 B基因的表达量研究[J]. 畜牧与兽医, 2016, 48(5):66-70.
[23] 习欠云, 焦莉, 肖敏, 等. GDF9下调转基因小鼠模型对繁殖与生长的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(7):1157-1162.
[24] 张曼, 孙秀萍, 宋铭晶. 慢病毒载体用于转基因技术的研究进展[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2014, 8(10):1949-1953.
[25] 唐大运, 朱化彬, 吴健敏, 等. Myostatin基因沉默绵羊成纤维细胞系的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2011, 42(10):1368-1373.

GDF9慢病毒载体的构建及其在山羊原代成纤维细胞中的稳定表达

Construction of GDF9 Lentiviral Vector and Its Stable Expression in Goat Primary Fibroblasts

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	吕春荣, 梁家充, 邵庆勇, 吴国权, 张玉梅, 权国波. 丙酮酸钠对山羊冷冻精子质量的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(6): 2363-2369.
[2]	宋兴超, 孟金柱, 赵园园, 吴震洋, 安清明. 贵州白山羊MyoG基因启动子区序列克隆及生物信息学分析[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(3): 893-903.
[3]	萨初拉, 吴铁成, 马跃军, 何云梅, 朱莉仙, 何托雅, 武玉平, 刘斌. 绒山羊4个多胎性状候选基因多态性及其与产羔数的关联分析[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(3): 1037-1047.
[4]	韦义荣, 郑自华, 张叁保, 宋颖, 蒋海玉, 孙雯玥, 程鹏飞, 刘雨帆, 邹剑伟, 黄艳娜, 潘艳, 蒋钦杨. 努比亚山羊UCP1基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(2): 440-450.
[5]	秦志云, 姜怀志. 羊胎儿期皮肤毛囊发育及调控机制的研究概述[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(2): 638-646.
[6]	但一昕, 向华, 张焕容, 杨璐, 任玉鹏, 徐颂为, 何翃闳, 朱江江. 羊口疮病毒129蛋白互作宿主蛋白的筛选与C1QBP基因的克隆分析[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(1): 1-14.
[7]	潘思尧, 张丹丹, 刘权辉, 王国栋, 吕丹薇, 黄奔. 抑制miR-142-3p对奶山羊化学诱导乳腺上皮细胞泌乳功能的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(1): 58-66.
[8]	刘泽林, 杨娟, 许铭洙, 张年, 熊琪, 刘静波, 陶虎. 山羊ZBP1基因多态性及与产羔性能的关联分析[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(1): 161-173.
[9]	王广, 邹家浩, 张永涛, 李德娴, 李雪清, 余梦琦, 陈璐, 袁宇欣, 李广. 关中奶山羊睾丸不同发育阶段代谢物的差异分析[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(9): 3453-3464.
[10]	冯小品, 李隐侠, 张晨俭, 张俊, 孟春花, 钱勇, 曹少先. 波尔山羊PLAG1基因克隆、多态性鉴定及其与出生体重、体尺性状的关联分析[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(9): 3465-3474.
[11]	唐井玉, 杜汉宇, 孟春春, 刘光清. 山羊干扰素刺激基因15克隆、生物信息学分析及亚细胞定位[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(8): 2843-2854.
[12]	张权威, 都萌萌, 程明, 戴正浩, 刘开东, 林晓坤, 高而尚, 秦至莉, 赵金山, 李和刚. 崂山奶山羊无角间性综合征生殖缺陷基因的基因型分析[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(8): 3054-3061.
[13]	邹剑伟, 邹菊红, 申玉建, 韦一, 张叁保, 连子童, 徐建建, 宋颖, 黄艳娜, 韦英明, 蒋钦杨, 郑自华. 努比亚山羊LMCD1基因生物信息学分析、真核表达载体的构建及表达[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(6): 2033-2042.
[14]	包跃先, 赵飞飞, 宫文典, 卢泽宇, 穆卿, 刘俊阳, 特日格乐, 赵艳红. 催乳素对内蒙古绒山羊毛囊体外培养影响的研究[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(6): 2072-2078.
[15]	王东, 梁加越, 王笑冰, 冯娟, 张茹, 夏慧岩, 肖红梅. 绒山羊毛囊发育中非编码RNA的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(5): 1817-1827.