Smad泛素化调节因子2 siRNA的筛选及转染原代肾小管上皮细胞条件的优化

摘要/Abstract

摘要： 试验旨在优化Smad泛素化调节因子2（Smurf2） siRNA最佳转染条件，筛选最佳siRNA干扰片段，进而实现对Smurf2基因的瞬时沉默，为研究Smurf2基因在马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephrohathy，AAN）中的作用奠定基础。本研究通过培养小鼠原代肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells，RTECs），并以脂质体Lipofectamine^TM 2000为转染介质，将Smurf2 siRNA转染入RTECs；通过观察绿色荧光的表达量及Real-time PCR反应优化转染条件，转染后Real-time PCR检测mRNA表达抑制率。CCK-8法检测Smurf2 siRNA复合物对RTECs活性的影响；同时，用Real-time PCR和Western blotting检测不同位点Smurf2 siRNA对Smurf2 表达的影响。结果显示,当Lipofectamine^TM 2000与siRNA比例为1.5 μL∶30 pmol时，转染效率最高，为70%～80%；Smurf2-619 siRNA干扰效果最明显；与正常组相比，转染siRNA组的Smurf2蛋白表达水平显著下降（P<0.05）。最终确定了Smurf2 siRNA最佳转染条件，其中Smurf2-619 siRNA对Smurf2 表达的抑制率最高。

关键词: Smad泛素化调节因子2; 转染; siRNA; 肾小管上皮细胞; 优化

Abstract: To lay the foundation for investigating the role of smurf2 in aristolochic acid nephropathy,we optimized the best transfection condition of Smurf2 siRNA,and screenned the best siRNA fragment,then realized the Smurf2 transient gene silencing. We cultured renal tubular epithelial cells (RTECs),Lipofectamine^TM 2000 was taken for transfection medium,transfecting Smurf 2 siRNA into RTECs,the transfection condition was optimized by observing expressions of green fluorescences and undertaking Real-time PCR reactions.After transferring the Smurf2 siRNA, mRNA inhibition ratios were detected by Real-time PCR.We detected the effects of compound Smurf2 siRNA on RTECs activity by CCK-8;at the same time,we detected the expression of Smurf2 under different sites of Smurf2 siRNA by Real-time PCR and Western blotting. The results showed that the best transfection condition was 1.5 μL Lipofectamine^TM 2000 and 30 pmol siRNA,the transfection efficiency was 70% to 80%.Smurf2-619 siRNA was proved with the most obvious interference effect.Smurf2 protein levels decreased significantly in the group of Smurf2 siRNA compared with the normal group （P<0.05）.We determined the best transfection condition of Smurf2 siRNA, Smurf2-619 siRNA had the highest inhibition rate for the expression of Smurf2.

Key words: Smad ubiquitination regulatory factor 2; transfection; siRNA; renal tubular epithelial cells; optimization

赵海焦，高磊，陆彦，田娅慧，贾志华，田海燕，吴国娟，张中文. Smad泛素化调节因子2 siRNA的筛选及转染原代肾小管上皮细胞条件的优化[J]. 中国畜牧兽医, 2014, 41(1): 19-24.

ZHAO Hai-jiao,GAO Lei,LU Yan,TIAN Ya-hui,JIA Zhi-hua,TIAN Hai-yan,WU Guo-juan,ZHANG Zhong-wen. Screening and Transfection Condition Optimization of Smurf2 siRNA in Renal Tubular Epithelial Cells[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2014, 41(1): 19-24.

参考文献

1 文姬.泛素蛋白酶体系统与肾脏疾病[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2005，14(5):465～467.
2 邓清华，刘国文，付世新，等.RNAi及沉默通路调控研究进展[J].中国畜牧兽医，2011，38(1)：92～95.
3 廖芳芳，李娇，王惠川，等.Arkadia表达载体转染肾小管上皮细胞条件的优化[J].中国畜牧兽医，2012，39（8）：44～47.
4 Bonni S,Wang H R, Causing C G,et al.TGF-beta induce sassembly of a Smad2-Smurf2 ubiquitin ligase complex that targets SnoN for degradation[J].Nat Cell Biol,2001,3(6):587～595.
5 Brummelkamp T R,Bernards R,Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs inmammalian cells[J].Science,2002,296:550～553.
6 Cunha F M,Berti D A,Ferreira Z S,et al.Intracellular peptides as natural regulators of cell signaling[J].J Biol Chem, 2008,283(36):24448～24459.
7 Goni C S,Rao J S.Concepts in vivo siRNA delivery for cancer therapy[J].Cell Physiol,2009,220:285～291.
8 Hirohiko H.Enhancement of RNAi activity by improved siRNA duplexes[J].FEBS Letters,2004,557(1～3):193～198.
9 Inoue Y,Imamura T.Regulation of TGF-beta family signaling by E3 ubiquitin ligases[J].Cancer Sci,2008,99(11):2107～2112.
10 Kavsak P,Rasmussen R K,Causing C G,et al.Smad7 binds to Smurf2 to form an E3 ubiquitin ligase that targets the TGF beta receptor for degradation[J].Mol Cell,2000,6(6):1365～1375.
11 Lonn P,Morén A,Raja E,et al.Regulating the stability of TGF-β receptors and Smads[J].Cell Res,2009,19(1):21～35.
12 Mohammed A,John J R,Dongho K.Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi[J].FEBS Letters,2005,579:5974～5981.
13 Peister A,Mellad J A,Wang M,et al.Stable transfection of MSCs by electroporation[J].Gene Ther,2004,11(2):224.
14 Ramaswamy G,Frank J S.siRNA:A guide for RNA silencing[J].Chemistry and Biology,2002,9(10):1053～1057.
15 Reinstein E,Cieehanover A. Narrative review:Protein degradation and human diseases:The ubiquitin connection[J].Ann Intern Med,2006,145(9):676～684.
16 Zhu H,Kavsak P,Abdollah S,et al.A SMAD ubiquitin ligase targets the BMP pathway and affects embryonic pattern formation[J].Nature,1999,400(6745):687～693.

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[1]	莘若兰, 周祉玉, 张嘉雯, 杜吉革, 印春生, 王凤雪, 陈小云, 温永俊, 朱真. 携带eGFP基因的重组牛结节性皮肤病病毒的构建及其生长特性研究[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(12): 5479-5488.
[2]	杜晓悦, 张良, 李慧萍, 刘淑英. 绵羊SUN2基因生物信息学分析及其在A549细胞中的表达[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(11): 3929-3939.
[3]	张万锋, 黑伟, 何志强, 刘敏, 孟珊, 高鹏飞, 蔡春波, 杨阳, 郭晓红, 曹果清, 李步高. 3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(5): 1352-1359.
[4]	李文, 韩玉萍, 赵向远, 范冰峰, 李晓霞, 刁云飞, 杨镒峰, 许保增. 腺病毒载体转染水貂耳缘成纤维细胞的研究[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(1): 37-43.
[5]	李希辰, 雷欢, 李雪, 石晶, 殷玉和, 吴丛梅. 一种犬细小病毒基因工程抗体的制备[J]. 中国畜牧兽医, 2019, 46(10): 3042-3051.
[6]	陈明明, 李燕, 张晓娟, 张林林, 李新, 丁向彬, 刘新峰, 郭宏. 3种转染试剂对牛原代骨骼肌卫星细胞转染条件的优化[J]. 《中国畜牧兽医》, 2019, 46(1): 62-71.
[7]	张梦瑶, 杨峰, 刘开东, 程明, 王国义, 刘积凤, 柳楠, 贺建宁. 敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(1): 131-139.
[8]	王洋, 金一. siRNA及其运载系统研究进展[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(5): 1281-1288.
[9]	曹洋, 尤双, 姚洋, 李村院, 陈创夫, 倪伟, 胡圣伟. 环状RNA mmu-circ-Pax3.1表达载体的构建及初步验证[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(10): 2865-2870.
[10]	邢书涵, 李方舟, 曹玉桃, 顾美超, 倪和民, 刘云海, 郭勇. 利用脂质体法建立转Toll样受体4基因大尾寒羊胎儿成纤维细胞株的研究[J]. , 2016, 43(5): 1125-1132.
[11]	赵静雯, 陈国荣, 吴慧光. miRNA合成途径研究进展[J]. , 2015, 42(12): 3186-3191.
[12]	宋庆庆, 李群, 李甜甜, 黄海琼, 范娟, 李玉和. 表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定[J]. , 2014, 41(12): 94-98.
[13]	高磊, 赵海焦, 吴金栋, 田娅慧, 张中文, 吴国娟. 泛素化调节因子2真核表达质粒的构建及其在原代肾小管上皮细胞的表达[J]. , 2013, 40(6): 37-40.
[14]	张敏, 刘微, 李擎, 郭春燕, 何俊霞, 斯日古楞, 吉日木图. 基因转染技术及其在肿瘤研究中应用的研究进展[J]. , 2013, (5): 71-74.
[15]	邓廷贤, 庞春英, 张滢寅, 杨炳壮, 张秀芳, 梁贤威. 脂质体法转染水牛肾脏成纤维细胞条件的优化[J]. , 2013, (5): 119-122.