中国畜牧兽医 ›› 2014, Vol. 41 ›› Issue (1): 19-24.
赵海焦1,高磊1,陆彦1,田娅慧1,贾志华1,田海燕2,吴国娟1,张中文1
ZHAO Hai-jiao1,GAO Lei1,LU Yan1,TIAN Ya-hui1,JIA Zhi-hua1,TIAN Hai-yan2,WU Guo-juan1,ZHANG Zhong-wen1
摘要: 试验旨在优化Smad泛素化调节因子2(Smurf2) siRNA最佳转染条件,筛选最佳siRNA干扰片段,进而实现对Smurf2基因的瞬时沉默,为研究Smurf2基因在马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephrohathy,AAN)中的作用奠定基础。本研究通过培养小鼠原代肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs),并以脂质体LipofectamineTM 2000为转染介质,将Smurf2 siRNA转染入RTECs;通过观察绿色荧光的表达量及Real-time PCR反应优化转染条件,转染后Real-time PCR检测mRNA表达抑制率。CCK-8法检测Smurf2 siRNA复合物对RTECs活性的影响;同时,用Real-time PCR和Western blotting检测不同位点Smurf2 siRNA对Smurf2 表达的影响。结果显示,当Lipofectamine TM 2000与siRNA比例为1.5 μL∶30 pmol时,转染效率最高,为70%~80%;Smurf2-619 siRNA干扰效果最明显;与正常组相比,转染siRNA组的Smurf2蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。最终确定了Smurf2 siRNA最佳转染条件,其中Smurf2-619 siRNA对Smurf2 表达的抑制率最高。