畜禽源3种革兰氏阴性杆菌多重PCR检测方法的建立与应用

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2016.03.003

›› 2016, Vol. 43 ›› Issue (3): 577-584.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2016.03.003

畜禽源3种革兰氏阴性杆菌多重PCR检测方法的建立与应用

马光强¹, 刘丽娟¹, 龙丹丹¹, 岳筠², 李毅², 文明^1,3, 程振涛^1,3, 周碧君^1,3

1. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025;
2. 贵州省动物疫病预防控制中心, 贵阳 550008;
3. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室, 贵阳 550025

收稿日期:2015-10-08 出版日期:2016-03-20 发布日期:2016-03-30
通讯作者: 程振涛, 周碧君 E-mail:chengzhentao@sohu.com;as.bjzhou@gzu.edu.cn
作者简介:马光强(1987-),男,贵州石阡人,硕士生,研究方向:动物细菌性疫病,E-mail:742975562@qq.com
基金资助:
贵州省农业攻关项目(黔科合NY[2014]3042号);贵州省科技创新人才团队项目(黔科合人才团队[2015]4016号)

Establishment and Application of Multiplex PCR Detection Method for Three Main Gram-negative Bacilli from Livestock and Poultry

MA Guang-qiang¹, LIU Li-juan¹, LONG Dan-dan¹, YUE Jun², LI Yi², WEN Ming^1,3, CHENG Zhen-tao^1,3, ZHOU Bi-jun^1,3

1. College of Animal Science, Guizhou Uiversity, Guiyang 550025, China;
2. Animal Disease Prevention and Control Center in Guizhou Province, Guiyang 550008, China;
3. Key Laboratory of Animal Disease and Veterinary Public Health in Guizhou Province, Guiyang 550025, China

Received:2015-10-08 Online:2016-03-20 Published:2016-03-30

摘要/Abstract

摘要： 为建立一种可准确、快速鉴定畜禽临床病例中3种常见革兰氏阴性杆菌的多重PCR检测方法,本试验针对大肠埃希菌23S rRNA基因、巴氏杆菌KMT基因和沙门氏菌invA基因分别设计合成了1对特异性引物,构建可同时快速鉴别大肠埃希菌、巴氏杆菌和沙门氏菌的多重PCR反应体系,并进行反应条件优化及方法性能评估。结果显示,所建立的方法最佳引物浓度分别为1.0、1.5和1.0 μmol/L,最佳退火温度为56 ℃。性能评价结果显示,所建立的多重PCR检测方法具有较好的特异性和敏感性,其中对沙门氏菌检测敏感性最高,为1.44 pg/μL。对70株革兰氏阴性临床分离细菌进行检测,结果表明,所建立的多重PCR检测方法能实现3种临床分离细菌的快速准确鉴定。本方法的建立为相关临床病例快速诊断及流行病学调查提供了有效的技术支持。

关键词: 多重PCR; 大肠埃希菌; 巴氏杆菌; 沙门氏菌

Abstract: To establish a rapid and accurate multiplex PCR method for the clinical detection of three main Gram-negative bacilli from livestock and poultry in Guizhou province,three pairs of specific primers were designed and synthetized according to 23S rRNA gene of Escherichia coli(E.coli),KMT gene of Pasteurella and invA gene of Salmonella.In this study,A mutiplex PCR reaction system was established for detecting the three pathogens at the same time,and the reaction system was optimized and it's performance was evaluated.The results showed that the best concentration of primers was 1.0,1.5and 1.0 μmol/L,respectively,and the best annealing temperature was 56 ℃.The results of performance evaluation showed that the method had good specificity and sensitivity,the sensitivity of Salmonella could reach to 1.44 pg/μL,was the highest.70 Gram-negative clinical isolated strains were detected by the multiplex PCR and it was proofed that the method could identify the three pathogens rapidly and accurately,and it could provide effective technical for the rapid clinical diagnosis and epidemiological survey.

Key words: multiplex PCR; E.coli; Pasteurella; Salmonella

中图分类号:

S852.61

马光强, 刘丽娟, 龙丹丹, 岳筠, 李毅, 文明, 程振涛, 周碧君. 畜禽源3种革兰氏阴性杆菌多重PCR检测方法的建立与应用[J]. , 2016, 43(3): 577-584.

MA Guang-qiang, LIU Li-juan, LONG Dan-dan, YUE Jun, LI Yi, WEN Ming, CHENG Zhen-tao, ZHOU Bi-jun. Establishment and Application of Multiplex PCR Detection Method for Three Main Gram-negative Bacilli from Livestock and Poultry[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2016, 43(3): 577-584.

参考文献

[1] 刁有祥,李久芹,陈庆普.山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报,2002,24(1):23-25.
[2] 严玉霖,雷华,杨尚斌,等.鹅大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医,2011,38(10):60-162.
[3] 吴信明,连洪梅,王艳,等.38株鸭源大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].中国畜牧兽医,2010,37(10):78-180.
[4] 李浩,刘阳,李长安.多杀性巴氏杆菌病研究进展[J].畜牧兽医杂志,2011,30(2):31-33.
[5] 张萍,冯芳.沙门氏菌的检测技术和方法的研究进展[J].食品安全质量检测学报,2015,6(5):1834-1841.
[6] 张江英.沙门氏菌检测方法的研究进展[J].家禽科学,2012,10:47-50.
[7] 游勇来.沙门氏菌的分离鉴定及PCR快速分型的研究[D].广州:华南理工大学,2013.
[8] 张曼.牛乳中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌多重PCR检测方法的建立及应用[D].杨凌:西北农林科技大学,2010.
[9] 白文彬,于康震.动物传染病诊断学[M].北京:中国农业出版社,2002.
[10] 徐海花,牛钟相,秦爱建,等.细菌耐药性研究进展[J].山东农业大学学报(自然科学版),2010,41(1):156-160.
[11] 刘晓丹.六种牛源致病性细菌多重PCR检测方法的建立[D].哈尔滨:东北农业大学,2013.
[12] 毕艳妮,宋宇,马淑青,等.多重PCR技术在病原微生物检测中的应用进展[J].中国微生态学杂志,2014,26(12):1476-1478.
[13] 王红宁.畜禽规模化养殖主要病原菌耐药性检测及控制技术研究进展[J].畜牧兽医科技信息,2002,9:12-15.
[14] 杨丽花.链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌多重PCR诊断方法的建立[D].杨凌:西北农林科技大学,2011.
[15] 许一平,成炜,邵彦春,等.沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测[J].微生物学通报,2006,33(6):89-94.
[16] Townsend K M,Boyce J D,Frost A J,et al,Development of PCR assays for species and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates[J].J Clin Microbiol,1998,36(4):1096-1100.
[17] Rhan K,De Grandis S A,Clarke R C.Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella[J].Mol Cell Probes,1992,6(4):271-279.

畜禽源3种革兰氏阴性杆菌多重PCR检测方法的建立与应用

Establishment and Application of Multiplex PCR Detection Method for Three Main Gram-negative Bacilli from Livestock and Poultry

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	吴鹏, 袁阳, 杨芸芸, 冯轶, 王艳, 杨颖, 陈江凤, 姜海波, 文明. 1例种鹅鸭瘟病毒与多杀性巴氏杆菌混合感染的诊断及病原鉴定[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(5): 2253-2265.
[2]	尹凯雯, 毛伟, 曹金山, 孙月, 董海燕, 韩凯凡, 王博, 李培锋, 张志丹, 樊宏亮, 郭宇, 赵红霞. 内蒙古地区牛呼吸道感染的主要病原菌及支原体分离鉴定及耐药性和毒力基因检测[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(3): 1328-1341.
[3]	李燕红, 李鋆涛, 杨天沐, 贾梦言, 熊文广. 基于CRISPR系统的禽源多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(2): 912-921.
[4]	冯新元, 赵佳雪, 龙金照, 胡景妍, 席岩岩, 陈帅印, 杨海燕, 段广才. 基于CRISPR序列的致泻性大肠埃希菌跨种传播风险机器学习模型构建[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(9): 4060-4065.
[5]	赵奕朵, 张康, 王磊, 路晓荣, 张景艳, 程佳, 郭志廷, 徐国伟, 黄莉萍, 牛宇辉, 马婷, 冯晓微, EGIDE, 刘明超, 李建喜. 1株牛源D:L3:L5型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及病原特性评价[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(7): 3128-3141.
[6]	薛雅茜, 谯薇美, 洪晓欣, 金宇航, 陆毅兴, 彭险峰, 曾振灵. 异丙氧苯胍与黏菌素联用对多杀性巴氏杆菌的体内外抗菌作用[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(2): 820-828.
[7]	卓玛. 1株牦牛源A∶L3型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及致病性分析[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(12): 5570-5576.
[8]	张蕾, 陈亮, 金振华, 冯万宇, 苗艳, 兰世捷, 秦平伟, 沈思思, 李丹, 张备, 董佳强, 黄宣凯, 李旭业, 江波涛, 王洪宝, 史同瑞. 1株羊源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及病原特性研究[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(1): 347-356.
[9]	何娅, 王召贺, 陈波, 宋玉平, 周明光, 徐高原. 猪源A型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗制备及免疫效果评估[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(9): 3752-3761.
[10]	王玉燕, 张林吉, 迟兰, 陈永亮, 任士飞, 孙朋. 鸡肉生产链中沙门氏菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型分析[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(8): 3345-3353.
[11]	汪阳阳, 秦士贞, 唐德富, 邵玉新, 史兆国, 王铮, 李星, 赵东栋. 锌、乳酸杆菌对感染沙门氏菌乳鸽免疫及抗氧化功能的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(6): 2276-2285.
[12]	李佳富, 莫小兵. 多杀性巴氏杆菌CRISPR-Cas系统生物信息学分析[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(5): 1742-1753.
[13]	张哲玮, 代小童, 韦祖丹, 陈云鹏, 甘晶, 贝为成. 猪多杀性巴氏杆菌OmpW、TbpA蛋白的原核表达及免疫原性研究[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(4): 1489-1498.
[14]	曹颖颖, 梁亮, 曾怡蓉, 钟清华, 袁小芳, 唐海波, 冷静. 滇西树鼩源沙门氏菌的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(4): 1718-1728.
[15]	牛小杰, 徐明国, 肖莉, 刘文豪, 陈创夫, 王勇. 鸡白痢沙门氏菌IPAJ蛋白的表达纯化、多克隆抗体制备及ELISA方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(3): 1218-1228.