H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立

›› 2014, Vol. 41 ›› Issue (10): 43-47.

H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立

赵虹¹, 谢芝勋², 谢丽基², 刘加波², 邓显文², 谢志勤², 庞耀珊², 范晴², 罗思思²

1. 广西大学动物科学技术学院, 广西南宁 530004;
2. 广西壮族自治区兽医研究所, 广西畜禽疫苗新技术重点实验室, 广西南宁 530001

收稿日期:2014-05-08 出版日期:2014-10-20 发布日期:2014-10-29
通讯作者: 谢芝勋 E-mail:xiezhixun@126.com
作者简介:赵虹(1988－),女,广西人,硕士,研究方向:动物传染病病原分子生物学。
基金资助:
广西特聘专家专项经费(2011B020);广西科技攻关重大专项(1222003-2-4);广西科技攻关项目(桂科攻10100014-5);广西重点实验室建设项目(12-071-28-A-3);广西重点实验室建设项目(12-071-28-A-4)

Establishment of Duplex PCR Assay for Detection of H9 Subtype Avian Influenza Virus and Duck Tembusu Virus

ZHAO Hong¹, XIE Zhi-xun², XIE Li-ji², LIU Jia-bo², DENG Xian-wen², XIE Zhi-qin², PANG Yao-shan², FAN Qing², LUO Si-si²

1. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China;
2. Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology, Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning 530001, China

Received:2014-05-08 Online:2014-10-20 Published:2014-10-29

摘要/Abstract

摘要： 本试验旨在建立一种能同时快速检测H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的二重PCR检测方法。根据GenBank中H9亚型 AIV的HA基因和DTMUV的NS2基因序列,分别设计了1对针对H9亚型AIV和DTMUV保守基因序列的引物。利用这2对引物对混有H9亚型AIV和DTMUV的cDNA模板进行二重PCR扩增,得到了2个大小与试验设计相符的特异性扩增条带。利用本试验建立的二重PCR对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。利用这2对引物对H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为6.3和 6.6 pg。对临床235份样品检测的结果表明该二重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。

关键词: H9亚型禽流感病毒; 鸭坦布苏病毒; 二重PCR

Abstract: The assay was aimed to establish a duplex PCR assay to detect H9 subtype avian influenza virus (AIV) and duck Tembusu virus (DTMUV) rapidly and simultaneously. According to the sequences of H9 AIV HA gene and DTMUV NS2 gene in GenBank,two sets of specific primers were designed. It was shown that all samples containing H9 subtype AIV and DTMUV could be amplified into two specific bands,but no specific bands were amplified from other duck disease virus. The sensitive determination result indicated that as little as 6.3 pg of H9 subtype AIV and 6.6 pg of DTMUV could be detected by this duplex PCR.Finally,based on 235 samples of clinical test indicated that this duplex PCR assay with the advantages of quick,sensitive and specific,could be useful for the clinical detection.

Key words: H9 subtype avian influenza virus; duck Tembusu virus; duplex PCR

中图分类号:

赵虹, 谢芝勋, 谢丽基, 刘加波, 邓显文, 谢志勤, 庞耀珊, 范晴, 罗思思. H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒二重PCR检测方法的建立[J]. , 2014, 41(10): 43-47.

ZHAO Hong, XIE Zhi-xun, XIE Li-ji, LIU Jia-bo, DENG Xian-wen, XIE Zhi-qin, PANG Yao-shan, FAN Qing, LUO Si-si. Establishment of Duplex PCR Assay for Detection of H9 Subtype Avian Influenza Virus and Duck Tembusu Virus[J]. , 2014, 41(10): 43-47.

参考文献

1 马秀丽,于可响,高凤,等. 一株鸭黄病毒的生物学特性研究[A]. 山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第二届禽病学术研讨会[C].2011.
2 甘孟侯.禽流感[M]. 北京:北京农业大学出版社,1995.
3 包红梅,王秀荣,陶启蒙,等. H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学,2010,40(4):384~389.
4 卢建红,刘秀梵,邵卫星,等. H9N2 亚型禽流感病毒基因组全长序列测定和各基因的遗传分析[J].微生物学报,2003,43(4):434~441.
5 许宗丽,谢芝勋,谢丽基,等. 鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国畜牧兽医,2013,40(4):26~31.
6 李瑾,申红卫,秦萌,等. 新型多重PCR方法及其在呼吸道病毒诊断上的应用[J].病毒学报,2013,29(6):638~645.
7 李国平. 鸭坦布苏病毒RT-PCR诊断方法的建立与应用[J].中国畜牧兽医,2013,40(1):69~71.
8 唐秀英,付朝阳,冯菊艳. H9 亚型禽流感的流行与防制[J].预防兽医学进展,2000,2(4):1~3.
9 曾婷婷,谢芝勋,谢丽基,等. 4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定[J].中国动物检疫,2013,30(6):31~35.
10 谢芝勋,谢丽基,刘加波,等. 禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯,2008,19(3):410~413.
11 谢丽基,谢芝勋,刘加波,等. 番鸭细小病毒与鸭圆环病毒二重 PCR方法的建立[J].中国动物检疫,2012,19(7):35~37.
12 滕巧泱,颜丕熙,张旭,等. 一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡[J].中国动物传染病学报,2010,18(6):1~4.
13 Cao Z Z,Zhang C,Liu Y H,et al. Tembusu virus in ducks,China[J].Emerg Infect Dis,2011,17(10):1873~1875.
14 Guo Y J,Krauss S,Senne D A,et al. Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages in Asia[J]. Virology,2000,267:279~288.
15 Li C,Yu K,Tian G,et al. Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in mainland China[J].Virology,2005,340(1):70~83.
16 Su J L,Li S,Hu X D,et al. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus,a new Tembusu-related flavivirus[J].PLoS One,2011,6(3):e18106.
17 Tashiro P,Ciborowski H D,Pulverer K G,et al. Role of Staphylococcus protein in the development of influenza pneumonia[J]. Nature,1987,325:536~537.
18 Xie Z X,Pang Y S,Liu J B,et al. A multiplex RT-PCR for type A influenza virus and differentiation of avian H5,H7 and H9 hemagglutinin subtypes[J].Mol Cell Probes,2006,20(3~4):245~249.
19 Yan P X,Zhao Y S,Zhang X,et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China[J].Virology,2011,417(1):1~8.

[1]	焦琳琳, 成玉婷, 吴庆国, 吴双, 吴植, 朱善元, 钱莺娟. 鸭坦布苏病毒Capsid蛋白原核表达及多克隆抗体制备[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(6): 2395-2402.
[2]	龙凤, 谢守玉, 崔鹏飞, 施开创, 韦显凯, 冯淑萍, 屈素洁, 陆文俊, 李剑锋, 尹彦文, 邓国华. 2016－2021年广西H9亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传进化动态分析[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(5): 1947-1958.
[3]	陈吉敏, 李辉煌, 赖连杰, 杨银华, 杨悦, 林瑞意. 鸭坦布苏病毒检测方法及疫苗研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(4): 1329-1339.
[4]	熊陈勇, 尹彦文, 施开创, 李军, 郑敏, 韦显凯, 冯淑萍, 龙凤, 屈素洁, 陆文俊, 周洪槿, 黄海莲, 谢守玉, 黎宗强. 2019-2021年鸭坦布苏病毒广西流行毒株遗传多样性分析[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(8): 3099-3111.
[5]	阴雅洁, 梁瑞英, 崔欢, 孟利佳, 倪维玲, 乔思娜, 郭康康, 张博, 李松励, 侯绍华, 董世山. 鸭坦布苏病毒分离鉴定及其囊膜蛋白遗传进化分析[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(4): 1497-1506.
[6]	何莹, 谢芝勋, 罗思思, 李孟, 谢丽基, 邓显文, 谢志勤, 奉彬, 黄娇玲, 张艳芳. 禽流感病毒与鸡细小病毒二重PCR检测方法的建立[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(7): 2126-2131.
[7]	吴植, 夏文龙, 蔡树东, 郭长明, 袁维峰, 王永娟. 鸭坦布苏病毒可视化RT-LAMP快速检测方法的建立与初步应用[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(11): 3334-3339.
[8]	路超, 张莉, 王利丽, 杨春蕾, 韩伟. 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立[J]. 《中国畜牧兽医》---唯一指定的官方网站, 2015, 42(6): 1377-1382.
[9]	赵雪丽, 闫若潜, 吴志明, 曹伟伟, 王淑娟, 谢彩华, 马震原, 周兵强, 王东方. 鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用[J]. , 2015, 42(4): 865-870.
[10]	王善辉, 谢金文, 吕颜枝, 李云龙. 鸭坦布苏病毒E基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性与保护性研究[J]. , 2015, 42(10): 2580-2586.
[11]	陈春丽, 王强, 李群芳, 严洁珍, 黄文科. 一株H9亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物特性研究[J]. , 2015, 42(10): 2619-2624.
[12]	张艳芳，谢芝勋，谢丽基，刘加波，范晴，庞耀珊，罗思思，邓显文，谢志勤. 鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2014, 41(3): 77-82.
[13]	张艳芳, 谢芝勋, 谢丽基, 刘加波, 范晴, 庞耀珊, 邓显文, 谢志勤. 鸭新城疫病毒与番鸭细小病毒二重PCR方法的建立[J]. , 2013, 40(11): 63-66.
[14]	郑良焰, 陈龙, 徐家华, 唐兆新. H9亚型禽流感病毒感染引起MDCK细胞内抗氧化功能的变化[J]. , 2013, 40(11): 175-179.
[15]	陈安莉, 谢芝勋, 谢丽基, 谢志勤, 庞耀珊, 邓显文, 刘加波, 彭宜, 范晴, 罗思思. 新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测方法的建立及初步应用[J]. , 2013, 40(11): 192-195.