利什曼原虫实时荧光定量PCR方法的建立

›› 2010, Vol. 37 ›› Issue (6): 164-167.

利什曼原虫实时荧光定量PCR方法的建立

张瑞岩1，商立民1，张宁2，刘全1，吴永魁1

（1.解放军军事医学科学院军事兽医研究所，长春 130062； 2.吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062）

收稿日期:1900-01-01 修回日期:2010-03-13 出版日期:2010-06-20 发布日期:2010-06-20
通讯作者: 刘全

Development of the Method for Detection and Quantitation of Leishmania with Real-time Fluorescent Quantitative PCR

ZHANG Rui-yan1，SHANG Li-min1，ZHANG Ning2，LIU Quan1，WU Yong-kui1

(1. Military Veterinary Institute，Academy of Military Sciences of PLA，Changchun 130062，China； 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China)

Received:1900-01-01 Revised:2010-03-13 Online:2010-06-20 Published:2010-06-20
Contact: LIU Quan

摘要/Abstract

摘要： 以利什曼原虫的小环状动基体DNA（Leishmania kDNA）为靶基因，建立实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法。根据GenBank报道的利什曼原虫小环状动基体DNA保守序列设计合成特异性引物，经PCR扩增后与pMD18-T载体连接，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑选阳性克隆重组质粒经鉴定正确后，作为模板建立SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果构建的标准曲线线性关系良好，相关系数为0.996，而且特异性强，重复性好。本研究成功建立了实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法，该方法可用于利氏曼原虫病的诊断、流行病学监测和科学研究。

关键词: 利氏曼原虫; 实时荧光定量PCR; 小环状动基体DNA

Abstract: To establish a SYBR-Green I fluorescent quantitative PCR method to detect the minicircles of the kinetoplast DNA of Leishmania，special primers were designed and synthesized to this conserved sequence. The special fragment was cloned into pMD18-T vector after PCR amplification，and then was transformed into E.coli DH5α. After the positive recombinant plasmid was identified，it was used as quantitative template to generate standard curve and melt curve. Results showed that the standard curve had a good linear relationship between cycle threshold(Ct) and template concentration，and the correlation coefficient was 0.996. We have successfully established a SYBR-Green I fluorescent quantitative PCR method to detect Leishmania，which can be used in the diagnosis and epidemiological surveillance of Leishmaniasis.

Key words: Leishmania; real-time fluorescent quantitative PCR; kDNA

中图分类号:

S852.72⁺9

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