分枝杆菌分型三重PCR检测方法的建立及应用

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2016.01.002

›› 2016, Vol. 43 ›› Issue (1): 8-15.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2016.01.002

分枝杆菌分型三重PCR检测方法的建立及应用

娄忠子¹, 刘聪暖¹, 贾万忠^1,2, 周继章¹, 闫鸿斌¹, 曹小安¹, 李立¹, 李兆才¹, 付宝权^1,2

1. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 家畜疫病病原生物学国家重点实验室, 农业部兽医公共卫生重点开放实验室, 甘肃省动物寄生虫病重点实验室, 兰州 730046;
2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009

收稿日期:2015-07-21 出版日期:2016-01-20 发布日期:2016-01-23
通讯作者: 付宝权 E-mail:fubaoquan@163.com
作者简介:娄忠子(1980-),男,山东泰安人,博士,助理研究员,研究方向:人兽共患细菌病,Tel:0931-8342675;E-mail:louzhongzi@caas.cn
基金资助:
甘肃省科技支撑计划农业类项目(1304NKCA162);甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2013-27)

Establishment and Application of Mycobacterium Typing Triple PCR Detection Method

LOU Zhong-zi¹, LIU Cong-nuan¹, JIA Wan-zhong^1,2, ZHOU Ji-zhang¹, YAN Hong-bin¹, CAO Xiao-an¹, LI Li¹, LI Zhao-cai¹, FU Bao-quan^1,2

1. Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province, Key Laboratory of Veterinary Public Health of Ministry of Agriculture, State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China;
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses, Yangzhou 225009, China

Received:2015-07-21 Online:2016-01-20 Published:2016-01-23

摘要/Abstract

摘要： 本研究旨在建立一种快速鉴定分枝杆菌的三重PCR方法,并比较分析其在临床检测中的可靠性。根据已发表的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌rv 3036c基因,结核分枝杆菌rv 1970f基因(RD7)和牛分枝杆菌pncA基因的序列,改造并设计合成了3对特异性扩增引物,建立了一种能对分枝杆菌样品进行初步鉴定的三重PCR方法。结果显示该方法可针对rv 3036c、rv 1970f和pncA基因分别扩增出大小为500、125和249 bp的目的片段,能特异性检测出结核分枝杆菌(500和125 bp两条带)和牛分枝杆菌(500和249 bp两条带),并可将结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与其他分枝杆菌加以区分。本方法的检测灵敏度为50 pg/μL模板基因组DNA。对86株抗酸染色阳性菌进行三重PCR鉴定,鉴定结果与细菌16S rDNA和ITS序列测定结果一致,检测准确度为100%,优于生长特征和生化试验鉴定。

关键词: 分枝杆菌; 结核分枝杆菌; 牛分枝杆菌; 三重PCR; 初步鉴定

Abstract: This study was aimed to establish a triple PCR method to rapidly identify Mycobacterium species, and evaluate its testing reliability.Three pairs of primer that were respectively specific to rv 3036c, rv 1970f and pncA genes of Mycobacterium were designed to establish a triple PCR for preliminary identification of Mycobacterium tuberculosis(M.tuberculosis), Mycobacterium bovis(M.bovis) and other Mycobacterium spp.PCR products were the expected sizes of 500(rv3036c), 125(rv1970f) and 249 bp(pncA), and contained two DNA bands(500 and 125 bp) with M.tuberculosis DNA template, two DNA bands(500 and 249 bp) with M.bovis DNA template.No band or non-specific band appeared with Mycobacterium spp.except M.tuberculosis and M.bovis DNA templates.The sensitivity of the triple PCR was calculated to 50 pg/μL template of genomic DNA.86 acid-fast bacteria were detected by the triple PCR, 16S rDNA and ITS gene sequencing, growth test and biochemical test, and the results were consistent between triple PCR and 16S rDNA and ITS gene sequencing.The detecting accuracy of triple PCR was 100%, and higher than growth test and biochemical test.

Key words: Mycobacterium; Mycobacterium tuberculosis; Mycobacterium bovis; triple PCR; preliminary identification

中图分类号:

S852.61⁺8

娄忠子, 刘聪暖, 贾万忠, 周继章, 闫鸿斌, 曹小安, 李立, 李兆才, 付宝权. 分枝杆菌分型三重PCR检测方法的建立及应用[J]. , 2016, 43(1): 8-15.

LOU Zhong-zi, LIU Cong-nuan, JIA Wan-zhong, ZHOU Ji-zhang, YAN Hong-bin, CAO Xiao-an, LI Li, LI Zhao-cai, FU Bao-quan. Establishment and Application of Mycobacterium Typing Triple PCR Detection Method[J]. , 2016, 43(1): 8-15.

参考文献

[1] 李卫民,刘毅,牛天贵,等.分枝杆菌的多相分类鉴定[J].国外医药抗生素分册,2007,28(2):64-69.
[2] Pounder J I,Anderson C M,Voelkerding K V,et al. Mycobacterium tuberculosis complex differentiation by genomic deletion patterns with multiplex polymerase chain reaction and melting analysis[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2010,67(1):101-105.
[3] Gordon S V,Rosch R,Billault A,et al.Pathogen genomes and human health[A].Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene Meeting at Mandon House[C].London:2001.
[4] 陈菲菲,王春芳,钱爱东.非结核性分支杆菌的致病性及其鉴定方法[J].中国畜牧兽医,2013,40(1):169-171.
[5] Riska P F,Jacobs W J,Alland D.Molecular determinants of drug resistance in tuberculosis[J]. Int J Tuberc Lung D,2000,42(suppl 1):4-10.
[6] 陈明洁,方倜,柯涛,等.多重PCR——一种高效快速的分子生物学技术[J].武汉理工大学学报,2005,27(10):33-36.
[7] 冯洁,谢建云,胡建华,等.3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国畜牧兽医,2015,42(6):1389-1395.
[8] 程实,陈伟,陈颖钰,等.结核分枝杆菌复合群四重PCR检测方法的建立及应用[J].中国人兽共患病学报,2012,28(4):333-337.
[9] Lee H R,Kim S Y,Chang H E,et al.Novel multiplex PCR using dual-priming oligonucleotides for detection and discrimination of the Mycobacterium tuberculosis complex and M.bovis BCG[J]. J Clin Microbiol,2010,48(12):4612-4614.
[10] Shah D H,Verma R,Bakshi C S,et al.A multiplex-PCR for the differentiation of Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis[J]. FEMS Microbiol Lett,2002,214(1):39-43.
[11] 谢芝勋,谢志勤,雷剑明,等.结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测[J].中国人兽共患病学报,2008,24(12):1141-1144.
[12] Jabbar A,Khan J,Ullah A,et al.Detection of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis from human sputum samples through multiplex PCR[J]. Pak J Pharm Sci,2015,28(4):1275-1280.
[13] 张喜悦,呼西旦,曹瑞,等.多重PCR方法鉴定牛结核分枝杆菌的研究[J].中国动物检疫,2013,30(7):68-71.
[14] 朱汝仪,潘文,赵明秋,等.结核分枝杆菌与牛分枝杆菌PCR快速鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学,2010,40(4):378-383.
[15] Gopinath K,Singh S.Multiplex PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complexes and other Mycobacterial species directly from clinical specimens[J]. J Appl Microbiol,2009,107(2):425-435.
[16] 孟祥红,匡铁吉,董梅.应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌[J].解放军医学杂志,2007,32(11):1177-1183.
[17] 王桂荣,付育红,梁倩,等.应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的研究[J].中国防痨杂志,2013,35(9):686-689.
[18] Crofton J,Chaulet P,Maher D,et al.Guidelines for the management of drug-resistant tuberculosis[M].WHO,1997.
[19] Sharma K,Mewara A,Gupta N,et al.Multiplex PCR in diagnosis of M.tuberculosis and M.avium co-infection from lymph node in an AIDS patient[J]. Indian J Med Microbiol,2015,33(Suppl):151-153.
[20] 万彦彬.用PCR-限制性长度多态性鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌[J].实用预防医学,2010,17(5):879-882.
[21] 曹俊,陈利苹,刘银冰,等.结核分枝杆菌rv 3036c基因的原核表达及其多克隆抗体的制备[J].中国预防兽医学报,2013,35(8):684-686.
[22] 陈玉芊.临床痰标本中L型细菌的筛查及结核分枝杆菌利福平依赖变异研究[D].兰州:兰州大学,2010.
[23] 刘思国,王春来,宫强,等.牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国预防兽医学报,2006,28(1):80-83.
[24] Garnier T,Eiglmeier K,Camus J C,et al.The complete genome sequence of Mycobacterium bovis[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(13):7877-7882.

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Establishment and Application of Mycobacterium Typing Triple PCR Detection Method

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[1]	林伟东, 隋修锟, 王召阳, 贾红, 房立春, 王海春, 朱良全, 鑫婷. 牛分枝杆菌MarP蛋白的表达纯化及其单克隆抗体制备[J]. 《中国畜牧兽医》, 2019, 46(6): 1774-1782.
[2]	周曼莉, 周玉成, 张海威, 乔连江, 杨艳玲. 牛分枝杆菌MPB70蛋白单克隆抗体的制备及检测[J]. 中国畜牧兽医, 2019, 46(10): 3075-3083.
[3]	高新桃, 贾红, 侯绍华, 杨宏军, 郭晓宇, 袁维峰, 姜一曈, 朱鸿飞, 鑫婷, 丁家波. 11种牛分枝杆菌抗原在牛结核病诊断中的初步评价[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(8): 2282-2292.
[4]	何萍, 赵孟成, 王灵, 黄增帅, 陈堡, 黄俊峰, 宋厚辉, 杨杨. 利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(11): 3018-3024.
[5]	郭佳成, 任宁宁, 郭爱珍, 陈颖钰. 结核分枝杆菌PhoP-PhoR双组分系统研究进展[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(11): 3253-3260.
[6]	张通明, 宋天琪, 鑫婷, 朱鸿飞, 贾红. 牛分枝杆菌eis基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其生物学活性鉴定[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(7): 2079-2085.
[7]	刘永安, 李学瑞, 刘永生. 结核分枝杆菌耐药机制与检测技术研究进展[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(6): 1884-1889.
[8]	竺婷婷, 卜棚, 刘晗, 彭永崇, 陈颖钰, 郭爱珍. IL-10在结核分枝杆菌感染和免疫中作用的研究进展[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(5): 1462-1467.
[9]	杨敏, 王慧党, 于潞, 吴长新, 张辉, 曹旭东, 陈创夫. 环介导等温扩增法检测牛奶中结核分枝杆菌条件的优化[J]. 《中国畜牧兽医》---唯一指定的官方网站, 2016, 43(7): 1688-1693.
[10]	孟露萍, 史梦婷, 包海洋, 付强, 史慧君, 王慧勤, 乔军, 张辉, 陈创夫. 结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对RAW264.7细胞凋亡的影响[J]. , 2016, 43(4): 892-898.
[11]	王晓龙, 卢天成, 王秀然, 杨艳玲. 鹿结核分枝杆菌MPB70蛋白的表达与免疫原性鉴定[J]. 《中国畜牧兽医》, 2016, 43(12): 3135-3140.
[12]	程振涛, 岳筠, 张华, 周碧君, 文明, 王开功, 欧德渊, 覃岚, 徐春志. 牛结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. , 2015, 42(8): 1979-1985.
[13]	冯洁, 谢建云, 胡建华, 高诚. 3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 《中国畜牧兽医》---唯一指定的官方网站, 2015, 42(6): 1389-1395.
[14]	李明, 贾红, 鑫婷, 郭晓宇, 袁维锋, 侯邵华, 侯强, 高新桃, 吴竞, 董瑞凯, 杨宏军, 刘来兴, 朱鸿飞. 牛分枝杆菌Mb1230基因的表达纯化及其活性评价[J]. , 2015, 42(10): 2544-2550.
[15]	高新桃，李平俊，鑫婷，贾红，郭晓宇，张改梅，李明，刘淑清，朱鸿飞，许雷. 牛分枝杆菌重组蛋白TB27.4的表达、纯化及活性鉴定[J]. 中国畜牧兽医, 2014, 41(8): 61-65.