维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA的克隆及原核表达

中国畜牧兽医

维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA的克隆及原核表达

翟新新¹，温振才¹，沈雪飞¹，孙真¹，贾生美¹，张俊辉¹，王文东²，杨振国¹，卢强¹

（1.吉林大学人兽共患病研究所，吉林长春 130062；2.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062)

修回日期:2014-04-10 出版日期:2014-07-20 发布日期:2014-08-21
通讯作者: 卢强(1970—)，男，教授，硕士生导师，主要从事人兽共患病毒病与分子免疫学研究。E-mail:qlu@jlu.edu.cn；Tel:0431-87836717
作者简介:翟新新(1988—)，女，山东人，硕士生，研究方向: 兽医公共卫生学。
基金资助:
国家自然科学基金(30972277)。

Cloning and Prokaryotic Expression of Aeromonas veronii Flagellin flaA

ZHAI Xin-xin¹，WEN Zhen-cai¹，SHEN Xue-fei¹，SUN Zhen¹，JIA Sheng-mei¹，ZHANG Jun-hui¹，WANG Wen-dong²，YANG Zhen-guo¹，LU Qiang¹

（1.Institute of Zoonoses，Jilin University，Changchun 130062，China；2.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China）

Revised:2014-04-10 Online:2014-07-20 Published:2014-08-21

摘要/Abstract

摘要： 本试验旨在利用大肠杆菌BL21（DE3）表达维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA，通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性。根据GenBank公布的序列设计1对引物，经PCR扩增获得flaA基因的完整开放阅读框序列，克隆至原核表达载体pET-30a，转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导、表达和纯化。SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌成功表达，约在38 ku处可见清晰的表达产物，诱导产物大小与理论值相符。经Western blotting检测，结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体和His-tag抗体发生免疫反应。因此，本试验成功表达了维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA，为进一步研究其生物学功能及免疫佐剂作用奠定了基础。

关键词: 维氏气单胞菌; 鞭毛蛋白; 克隆; 表达

Abstract: This study was aimed to express Aeromonas veronii flagellin flaA in E.coli BL21(DE3) and preliminarily identify antigenicity of recombinant protein through Western blotting.A pair of primers was designed according to the published sequences in GenBank.Complete ORF sequence of flaA gene was obtained by PCR amplification and cloned into pET-30a vector，and then transformed into E.coli BL21(DE3) to induce，express and purify.SDS-PAGE results showed that the target protein was successfully expressed in E.coli BL21(DE3) and the product was consistent with the theoretical value and seen clearly at approximately 38 ku.Western blotting result showed that the expression of recombinant proteins could produce immune reaction with prepared antibody and His-tag antibody.Therefore,Aeromonas veronii flagellin flaA was successfully expressed, which laid the basis for further study the role of biological function and immune adjuvant of flagellin.

Key words:

Aeromonas veroniimso-bidi-font-family: 宋体">；flagellin；cloning；expression

翟新新，温振才，沈雪飞，孙真，贾生美，张俊辉，王文东，杨振国，卢强. 维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA的克隆及原核表达[J]. 中国畜牧兽医.

ZHAI Xin-xin，WEN Zhen-cai，SHEN Xue-fei，SUN Zhen，JIA Sheng-mei，ZHANG Jun-hui，WANG Wen-dong，YANG Zhen-guo，LU Qiang. Cloning and Prokaryotic Expression of Aeromonas veronii Flagellin flaA[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine.

参考文献

1 Azad I S, Shankar K M, Mohan C V, et al. Protective response of common carp orally vaccinated with biofilm and free cells of Aeromonas hydrophila challenged by injection and immersion routes［J］. Journal of Aquaculture in the Tropics，2000，15(1): 65～70.
2 Baba T, Imamura J, Izawa K, et al. Immune protection in carp, Cyprinus carpio L., after immunization with Aeromonas hydrophila crude lipopolysaccharide［J］. Journal of Fish Diseases，1988，11(3): 237～244.
3 Doring G, Meisner C, Stern M. A double-blind randomized placebo-controlled phase Ⅲ study of a Pseudomonas aeruginosa flagella vaccine in cystic fibrosis patients［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2007，104(26): 11020～11025.
4 Fang H M, Ge R, Sin Y M. Cloning, characterisation and expression of Aeromonas hydrophila major adhesin［J］. Fish & Shellfish Immunology，2004，16(5): 645～658.
5 Janda J M, Guthertz L S, Kokka R P, et al. Aeromonas species in septicemia: Laboratory characteristics and clinical observations［J］. Clinical Infectious Diseases，1994，19(1): 77～83.
6 Janda J M, Sussman M. Aeromonas and Plesiomonas［J］. Molecular Medical Microbiology，2002，2: 1237～1270.
7 Janda J M, Abbott S L. The genus Aeromonas: Taxonomy, pathogenicity, and infection［J］. Clinical Microbiology Reviews，2010，23(1): 35～73.
8 Khashe S, Hill W, Janda J M. Characterization of Aeromonas hydrophila strains of clinical, animal, and environmental origin expressing the O∶34 antigen［J］. Current Microbiology，1996，33(2): 104～108.
9 Kühn I, Albert M J, Ansaruzzaman M, et al. Characterization of Aeromonas spp. isolated from humans with diarrhea, from healthy controls, and from surface water in Bangladesh［J］. Journal of Clinical Microbiology，1997，35(2): 369～373.
10 Lamers C H J, Haas M J H, Muiswinkel W B. The reaction of the immune system of fish to vaccination: Development of immunological memory in carp, Cyprinus carpio L., following direct immersion in Aeromonas hydrophila bacterin［J］. Journal of Fish Diseases, 1985, 8(3): 253～262.
11 Leung K Y, Wong L S, Low K W, et al. Mini-Tn5 induced growth- and protease-deficient mutants of Aeromonas hydrophila as live vaccines for blue gourami,Trichogaster trichopterus(Pallas)［J］. Aquaculture，1997，158(1): 11～22.
12 Rabaan A A, Gryllos I, Tomás J M, et al. Motility and the polar flagellum are required for Aeromonas caviae adherence to HEp-2 cells［J］. Infection and Immunity, 2001, 69(7): 4257～4267.
13 Rahman M H, Kawai K. Outer membrane proteins of Aeromonas hydrophila induce protective immunity in goldfish［J］. Fish & Shellfish Immunology，2000，10(4): 379～382.
14 Reichhart J M.TLR5 takes aim at bacterial propeller［J］.Nat Immunol，2003(4): 1159～1160.
15 Samuel M, Lam T J, Sin Y M. Effect of laminaran ［beta(1,3)-D-Glucan］ on the protective immunity of blue gourami, Trichogaster trichopterus against Aeromonas hydrophila［J］. Fish & Shellfish Immunology，1996，6(6): 443～454.
16 Shiina Y, Ii K, Iwanaga M. An Aeromonas veronii biovar sobria infection with disseminated intravascular gas production［J］. J Infect Chemother，2004，10: 37～41.
17 Thune R L, Stanley L A, Cooper R K. Pathogenesis of gram-negative bacterial infections in warm water fish［J］. Annual Review of Fish Diseases，1993，3: 37～68.
18 Vazquez-Juarez R C, Gomez-Chiarri M, Barrera-Saldaa H, et al. Evaluation of DNA vaccination of spotted sand bass(Paralabrax maculatofasciatus) with two major outer-membrane protein-encoding genes from Aeromonas veronii［J］.Fish & Shellfish Immunology， 2005，19: 153～163.

[1]	李天秀, 李昕鹏, 董新星, 兰国湘, 严达伟, 朱家位. 丽江猪HMOX2基因扩增、序列分析及组织表达研究[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(5): 2219-2231.
[2]	黄小久, 雷磊, 彭小烨, 王开心, 陈英仪, 王济贤, 王玉格, 段德勇, 杨毅, 王爱兵. 稳定过表达NM-ⅡA Tail的IPEC-J2细胞系构建及其对PEDV感染的影响研究[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(5): 2243-2252.
[3]	刘敏, 程淮, 郑珍珍, 张梦思, 张贺伟, 任静强. 犬副流感病毒N蛋白的真核表达及多克隆抗体制备[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(5): 2287-2294.
[4]	胡慧慧, 付盼盼, 李杰, 闫尊强, 高小莉, 杨姣姣, 黄晓宇. 合作猪TRIF基因CDS区克隆鉴定及组织表达分析[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(4): 1478-1487.
[5]	张莹, 陈广振, 刘梅, 李红霞, 俞燕, 贾雪波, 李雯倩, 范建华, 马志禹. 半番鸭NMB基因克隆、生物信息学和组织表达分析[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(4): 1705-1715.
[6]	司维, 谭茜宇, 徐玲芸, 罗廷荣, 李晓宁, 顾金燕. H3N2亚型猪流感病毒HA1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(4): 1739-1749.
[7]	洪嘉俊, 肖金华, 张政, 杨雨婷, 方春, 韩旭. sod基因缺失对单增李斯特菌10403S抗氧化应激作用的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(4): 1776-1783.
[8]	苗书魁, 米晓云, 魏婕, 魏玉荣, 海力且木·买买提依明. G8型牛轮状病毒VP7基因克隆及生物信息学分析[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(4): 1784-1795.
[9]	武敏, 徐俊杰, 李欣欣, 陈一凡, 王德贺, 郝二英, 陈辉, 石雷. 基于转录组测序筛选调控黄羽肉鸡肌肉发育的关键基因[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(3): 990-1000.
[10]	黄念旎, 黄子珂, 李聪聪, 刘晗, 马诗语, 宋果, 蒋亮, 彭为波, 杨联熙, 黄生强. 九疑山兔FGF10基因克隆、生物信息学及组织表达分析[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(3): 1001-1010.
[11]	王泳, 那日苏, 梁建勇, 刘洋, 李九月, 高源, 田丰, 薛树媛. 槲皮素对蒙古羊卵泡发育、卵泡液微环境及卵巢类固醇生成相关基因表达的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(3): 1150-1158.
[12]	潘向英, 曾智勇, 梁海英, 汤德元, 王彬, 叶泥, 田红利, 边孟婷, 柳佳佳, 黄书. 猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(3): 1231-1240.
[13]	艾小楠, 程俐芬, 白璞, 陈正灏, 薛丽娜, 周胜花. 灵丘青背山羊ACSL1基因克隆、生物信息学分析及其在脂肪细胞分化过程中的表达研究[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(2): 499-511.
[14]	雷志刚, 潘宏, 张丹丹, 刘权辉, 孙哲, 邓珊, 黄奔. 马山黑山羊MAPK8基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体构建[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(2): 534-544.
[15]	王晴, 马瑜锴, 韩若冰, 邢海华, 孙子惠, 李和平. 梅花鹿CSRP3基因克隆、生物信息学分析及其在肌肉组织中的表达分析[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(2): 740-748.