牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3的表达及ELISA检测方法的建立

中国畜牧兽医

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3的表达及ELISA检测方法的建立

范晴，谢芝勋，谢志勤，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢丽基，罗思思

(广西兽医研究所，广西动物疫苗和新技术重点实验室，广西南宁 530001)

收稿日期:2013-12-16 出版日期:2014-05-20 发布日期:2014-06-25
通讯作者: 谢芝勋（1963—），研究员，研究方向：动物传染病及病原分子流行病学。E-mail: xiezhixun@126.com
作者简介:范晴（1982—），女，云南人，硕士，助理研究员，研究方向：分子病毒学。
基金资助:
广西自然科学基金面上项目(2011GXNSFA018096、2012GXNSFAA053074)；广西特聘专家专项（2011B020）；桂科专项（13-3）。

Expression of Nonstructural Protein NS3 and Establishment of ELISA Method of Bovine Viral Diarrhea Virus

FAN Qing, XIE Zhi-xun, XIE Zhi-qin, LIU Jia-bo, PANG Yao-shan, DENG Xian-wen, XIE Li-ji, LUO Si-si

（Guangxi Key Laboratory for Animal Vaccine and New Technologies, Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning 530001, China）

Received:2013-12-16 Online:2014-05-20 Published:2014-06-25

摘要/Abstract

摘要： 本研究旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗体的间接ELISA方法。将BVDV的非结构蛋白NS3基因克隆到原核表达载体pET-32a中进行表达，将纯化后的蛋白作为包被抗原，优化ELISA条件，建立了BVDV抗体间接NS3-ELISA检测方法，并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检测，结果均较好。用所建立的NS3-ELISA方法检测从广西各牛场采集的475份牛血清样品，检出率为24.8%，与商品化试剂盒比较，符合率为97%。结果表明，本研究建立的NS3-ELISA方法简便、快捷，可大批量检测，适用于BVDV的诊断、抗体水平监测及流行病学调查。

关键词: 牛病毒性腹泻病毒; NS3; ELISA

Abstract: An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method was developed to detect antibody against bovine viral diarrhea virus (BVDV). The nonstructural protein NS3 gene of BVDV was subcloned into prokaryotic vector pET-32a to express. The recombinant protein NS3 of BVDV was used as the coating antigen for the ELISA method, and the reaction conditions were optimized. The specificity, sensitivity and reproducibility all showed good results. Furthermore, four hundred and seventy five bovine serum samples, which had been collected from several cattle farms of Guangxi, were detected by the NS3-ELISA, and the positive rate of BVDV antibody was 24.8%. Compared with commercial kit, the coincidence was 97%. The result suggested that NS3-ELISA was a convenient, rapid method for the diagnosis, antibody level surveillance and epidemiologic investigation of BVDV.

Key words:

bovine viral diarrhea virus; NS3; ELISA

范晴，谢芝勋，谢志勤，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢丽基，罗思思. 牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS3的表达及ELISA检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医.

FAN Qing, XIE Zhi-xun, XIE Zhi-qin, LIU Jia-bo, PANG Yao-shan, DENG Xian-wen, XIE Li-ji, LUO Si-si. Expression of Nonstructural Protein NS3 and Establishment of ELISA Method of Bovine Viral Diarrhea Virus[J]. .

参考文献

1 毛晓娜，缪芬芳，季伟，等. 牛病毒性腹泻病毒在猪瘟疫苗中的污染情况及其检测方法的研究进展［J］. 中国畜牧兽医，2013，40(2)：175～179.
2 王丹娜，吴明福，吴立君，等，牛病毒性腹泻病毒P80 基因的分段表达及其抗原性分析［J］. 中国兽医科学，2006，36(4)：257～261.
3 邓显文，谢芝勋，刘加波，等. 肠炎沙门菌fliC蛋白的表达及ELISA检测方法的建立［J］. 动物医学进展，2013，34(6)：21～25.
4 张强，李树清，李健，等. 进口胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒污染的检测［J］. 中国动物检疫，2013，30(2)：55～57.
5 邱昌庆，郭慧琛，程淑敏，等. 安徽、江苏、广西部分地区水牛牛病毒性腹泻/粘膜病血清学监测［J］. 中国预防兽医学报，2000，22(6)：453～454.
6 范晴，谢芝勋，刘加波，等. 牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR 检测方法的建立［J］. 动物医学进展，2010，31(10)：10～14.
7 殷震，刘景华. 动物病毒学［M］. 北京：科学出版社，1997.
8 Dirk D, Edward J D, Michael J, et al. Mapping of two antigenic domains on the NS3 protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus［J］. Veterinary Microbiology, 2005, 108(1～2): 13～22.
9 Fan Q, Xie Z, Xie L, et al. A reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of bovine viral diarrhea virus［J］. Journal of Virological Methods, 2012, 186(1): 43～48.
10 Kalaycioglu A T. Bovine viral diarrhoea virus (BVDV) diversity and vaccination. A review［J］. Vet Q, 2007, 29(2): 60～67.
11 Kuijk H, Franken P, Mars M H, et al. Monitoring of BVDV in a vaccinated herd by testing milk for antibodies to NS3 protein［J］. Vet Rec, 2008, 163(16): 482～484.
12 Makoschey B, Sonnemans D, Bielsa J M, et al. Evaluation of the induction of NS3 specific BVDV antibodies using a commercial inactivated BVDV vaccine in immunization and challenge trials［J］. Vaccine, 2007, 25(32): 6140～6145.
13 Negron M, Raizman E A, Pogranichniy R, et al. Survey on management practices related to the prevention and control of bovine viral diarrhea virus on dairy farms in Indiana, United States［J］. Prev Vet Med, 2011, 99(2～4): 130～135.
14 Walz P H, Grooms D L, Passler T, et al. Control of bovine viral diarrhea virus in ruminants［J］. J Vet Intern Med, 2010, 24(3): 476～486.
15 Xie Z, Qin C, Xie L, et al. Recombinant protein-based ELISA for detection and differentiation of antibodies against avian reovirus in vaccinated and non-vaccinated chickens［J］. Journal of Virological Methods 2010, 165(1): 108～111.
16 Xie Z, Luo S, Fan Q, et al. Detection of antibodies specific to the non-structural proteins of fowl adenoviruses in infected chickens but not in vaccinated chickens［J］. Avian Pathology, 2013, 42(5): 491～496.

[1]	刘可欣, 王超, 张傲, 刘佳利, 谭斌, 张淑琴. 牛病毒性腹泻病毒LN-1株的分离鉴定及基因组序列分析[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(3): 1150-1159.
[2]	赵逢淼, 郭婷, 周雅坪, 赵红梅, 王宇琛, 田广原, 孙雅婕, 卞宇晨, 于佳梁, 郝永清. 牛病毒性腹泻病毒对新西兰白兔致病性分析及E2蛋白免疫效果的评价[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(9): 3549-3558.
[3]	邵百卉, 姜东君, 谢艺萌, 刘思雨, 邵子益, 张泽财, 计红, 朱战波. 青蒿素与牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白的分子对接预测及其抗病毒作用[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(9): 3581-3588.
[4]	王炜, 韩慧慧, 丁乃峥, 何成强. 牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(8): 3131-3139.
[5]	王慧慧, 冯茜莉, 蒲飞洋, 李易聪, 汪梦竹, 周小凯, 赵泽阳, 马忠仁, 李倬, 马晓霞. 牦牛源BVDV非结构蛋白NS5A的原核表达及抗原表位分析[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(8): 3180-3189.
[6]	任杰, 林泠, 汤德元, 曾智勇, 王彬, 禹光美, 郑如雯, 吴道义, 黄涛. 牛病毒性腹泻病毒E0-E2基因融合腺病毒的构建及小鼠免疫效果评价[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(6): 2056-2063.
[7]	麻宝艺, 盛陈艳, 刘宏莹, 马青霞, 汪婷婷, 李健明, 时坤, 杜锐, 冷雪. BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(6): 2326-2335.
[8]	吴桐忠, 努尔赛力克·努素甫, 黄新, 韩猛立, 张星星, 张倩, 王新华, 何延华, 钟发刚. 表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组乳酸菌的构建及蛋白免疫原性分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(8): 2975-2981.
[9]	付强, 贺渊秀, 李泽宇, 塞力克·杰恩斯, 周渝新, 杨莉, 冉多良, 史慧君. 小分子药物索非布韦对牛病毒性腹泻病毒体外复制的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(7): 2653-2660.
[10]	常丽云, 刘志勇, 秦建华, 赵月兰. 河北省唐山市奶犊牛病毒性腹泻流行病学调查[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(11): 4213-4219.
[11]	杨艳, 钱天皓, 张彦红, 张哲, 郝秀静, 李岩, 吕文华, 刘照, 盛金良. 牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白纳米抗体的筛选及反应原性检测[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(1): 303-311.
[12]	张超, 何金科, 何延华, 马旭升, 陈创夫. 胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒2型毒株分离及脱脂奶粉中抗体的检测[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(7): 2239-2247.
[13]	张淑琴, 谭斌, 刘泽余, 王超, 郭利, 孙娜, 程世鹏. 猪源牛病毒性腹泻病毒JLS-01株的分离鉴定及致病性研究[J]. 《中国畜牧兽医》, 2019, 46(2): 557-564.
[14]	何金科, 杨亚军, 邓肖玉, 何延华, 张超, 马忠臣, 王勇, 陈创夫. 牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白的生物信息学分析及多表位筛选[J]. 中国畜牧兽医, 2019, 46(12): 3475-3485.
[15]	李新培, 周伟光, 关平原, 程世鹏, 温永俊. 牛病毒性腹泻病毒致病机制研究进展[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(8): 2303-2311.