H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

中国畜牧兽医

H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

罗思思，谢芝勋，刘加波，邓显文，谢志勤，庞耀珊，谢丽基，范晴

（广西壮族自治区兽医研究所, 广西畜禽疫苗新技术重点实验室, 广西南宁 530001）

收稿日期:2013-06-28 出版日期:2014-02-20 发布日期:2014-03-27
通讯作者: 谢芝勋（1963—），男，广西人，二级研究员，研究方向：畜禽传染病分子生物学。E-mail:xiezhixun@126.com
作者简介:罗思思（1985—），女，广西人，硕士，研究实习员，研究方向：畜禽传染病分子生物学。
基金资助:
广西特聘专家专项（2011B020）；广西科技攻关重大专项（桂科重1222003-2-4）；广西科技攻关（1010014-5）。

Development of a Triplex PCR Assay for Detection of H7N9 Subtype Avian Influenza Virus

LUO Si-si, XIE Zhi-xun, LIU Jia-bo, DENG Xian-wen, XIE Zhi-qin, PANG Yao-shan, XIE Li-ji, FAN Qing

(Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccines and New Technology, Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning 530001,China)

Received:2013-06-28 Online:2014-02-20 Published:2014-03-27

摘要/Abstract

摘要： 为建立一种H7N9亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)的快速检测方法，本研究据H7亚型AIV HA基因、N9亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因的保守序列，分别设计了3对特异性引物，通过优化反应条件、特异性和敏感性试验，建立了H7N9亚型AIV三重PCR检测方法。该法对H7N9亚型AIV进行扩增，分别得到330(H7亚型AIV)、207(N9亚型AIV)和632 bp(AIV)的3条特异性条带；含有H7或N9亚型AIV的模板均出现2条特异性条带，大小分别为330和632、207和632 bp；含有其他亚型AIV的模板只出现1条特异性条带，大小为632 bp，对其他禽病病原体的检测均无条带。敏感性试验结果表明，该法最低能检测到10³ 拷贝/μL H7N9亚型AIV。本研究建立的H7N9亚型AIV三重PCR检测方法，一管检测既可确定是否为H7N9亚型AIV感染，还可确定单一H7亚型AIV、单一N9亚型AIV和其他亚型AIV感染，具有快速、特异和敏感的优点，为H7N9亚型AIV的临床检测及有效防控提供技术支持。

关键词: 禽流感病毒; H7N9亚型; 三重PCR

Abstract: In order to develop a rapid and simultaneous assay for H7N9 subtype avian influenza virus （AIV）, three pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the hemagglutinin (HA) gene of H7 subtype AIV, the neuramidinase (NA) gene of N9 subtype AIV, and the matix (M) gene of all subtypes AIV. The reaction conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of this method were evaluated to develop a triplex PCR assay. It was shown that H7N9 subtype AIV could be amplified into three specific bands by this triplex PCR, the lengths of these bands were 330 (H7 AIV), 207 (N9 AIV) and 632 bp (all AIV), respectively. Samples containing H7 or N9 subtype AIV could be amplified into two specific bands, which were 330 and 632, 207 and 632 bp, respectively. Samples containing other subtypes AIV could be amplified into a 632 bp specific band. No specific band was amplified from other avian pathogenic virus. Sensitivity test results showed that as low as 10³ copies/μL H7N9 subtype AIV could be detected. This triplex PCR could simultaneously diagnose H7N9 subtype AIV, single H7 subtype AIV, single N9 subtype AIV and other subtype AIV in one tube. This assay was a rapid, specific and sensitive method for the detection of H7N9 subtype AIV. It could be applied in rapid diagnosis for clinical samples, and also provided a technical support to prevent and control H7N9 subtype AIV.

Key words: avian influenza virus; H7N9 subtype; triplex PCR

罗思思，谢芝勋，刘加波，邓显文，谢志勤，庞耀珊，谢丽基，范晴. H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医.

LUO Si-si, XIE Zhi-xun, LIU Jia-bo, DENG Xian-wen, XIE Zhi-qin, PANG Yao-shan, XIE Li-ji, FAN Qing. Development of a Triplex PCR Assay for Detection of H7N9 Subtype Avian Influenza Virus[J]. .

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