灭菌乳中活阪崎肠杆菌PMA-PCR检测方法的建立

中国畜牧兽医

灭菌乳中活阪崎肠杆菌PMA-PCR检测方法的建立

刘艳艳¹，柳增善^{1，卢士英¹，任洪林¹，盖冬雪¹，崔成¹，丁艳霞¹，孟宪梅¹^，2，于师宇³}

（1.人兽共患病研究教育部重点实验室,吉林大学人兽共患病研究所,吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062；2.吉林工商学院粮油食品深加工吉林省高校重点实验室，吉林长春 130062；3.福建出入境检验检疫局，福建福州 350001）

修回日期:2013-12-02 出版日期:2014-02-20 发布日期:2014-03-27
通讯作者: 孟宪梅（1964―），女，吉林人，教授，硕士生导师，研究方向：食品安全。于师宇（1981―），女，福建人，硕士，高级兽医师，研究方向：食品安全。
作者简介:刘艳艳（1987―），女，山东人，硕士生，研究方向：兽医公共卫生。
基金资助:
吉林省世行贷款农产品质量安全项目（2011-Y36）；吉林省科技发展计划项目（201205054）。

Development of PMA-PCR Method for Detection of Viable Enterobacter sakazakii in Pasteurized Milk

LIU Yan-yan¹，LIU Zeng-shan¹，LU Shi-ying¹，REN Hong-lin¹，GAI Dong-xue¹，CUI Cheng¹，DING Yan-xia¹，MENG Xian-mei¹^，2，YU Shi-yu³

（1. Key Laboratory of Zoonosis Research，Ministry of Education， Institute of Zoonosis， College of Veterinary Medicine,Jilin University, Changchun 130062，China；2.Key Laboratory of Grain and Oil Processing of Jilin Province，Biological Engineering Department，Jilin Business and Technology College，Changchun 130062，China；3.Fujian Entry-exit Insection and Quarnatine Bureau，Fuzhou 350001，China）

Revised:2013-12-02 Online:2014-02-20 Published:2014-03-27

摘要/Abstract

摘要： 本试验旨在建立灭菌乳中活阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）的PMA-PCR检测方法。将DNA染料叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，PMA）与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术结合，优化PMA最佳工作浓度和曝光时间，确定PMA-PCR区别死、活阪崎肠杆菌细胞的最佳条件。结果表明，活阪崎肠杆菌经100 ℃沸水处理20 min可完全致死，PMA完全与死阪崎肠杆菌DNA共价交联并光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15 min，完全抑制死阪崎肠杆菌PCR扩增的最小PMA浓度为5 μg/mL，不抑制活阪崎肠杆菌PCR扩增的最大PMA浓度为15 μg/mL。经PMA处理后，在含有不同比例的死、活阪崎肠杆菌混合液中检测到活阪崎肠杆菌的最低检测限为40 CFU/mL，在灭菌乳样品中检测到活阪崎肠杆菌的最低检测限为100 CFU/mL。该方法为利用PMA-PCR检测食品中的活阪崎肠杆菌奠定了基础。

关键词: PMA; PCR; 阪崎肠杆菌; 灭菌乳

Abstract: In order to detect viable Enterobacter sakazakii in pasteurized milk，a new method was established by combination of propidium monoazide （PMA） and polymerase chain reaction （PCR）.PMA concentration and exposure time were optimized to find optimal conditions for distinguishing between dead and viable E.sakazakii. The results showed that to kill the viable E.sakazakii must be exposed to 100 ℃ for 20 min in water bath. The optimum light exposure time to intercalate the DNA of dead E.sakazakii and to photolyze the free PMA in solution was 15 min. The minimum concentration of PMA to completely inhibit the PCR amplication of dead bacterium was 5 μg/mL. The maximum concentration of PMA did not inhibit the PCR amplification of viable bacterium was 15 μg/mL. After PMA treatment，viable E.sakazakii in a mixture containing different proportions of dead and viable bacterium could be selectively detected by PCR，and the determination limit was 40 CFU/mL. In the pasteurized milk，the determination limit was 100 CFU/mL. This study laid a foundation for use of PMA-PCR to detect the E.sakazakii in the food.

Key words: PMA; PCR; Enterobacter sakazakii; pasteurized milk

刘艳艳，柳增善，卢士英，任洪林，盖冬雪，崔成，丁艳霞，孟宪梅，于师宇. 灭菌乳中活阪崎肠杆菌PMA-PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医.

LIU Yan-yan，LIU Zeng-shan，LU Shi-ying，REN Hong-lin，GAI Dong-xue，CUI Cheng，DING Yan-xia，MENG Xian-mei，YU Shi-yu. Development of PMA-PCR Method for Detection of Viable Enterobacter sakazakii in Pasteurized Milk[J]. .

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