牛支原体单克隆抗体的制备与鉴定

›› 2012, Vol. 39 ›› Issue (7): 58-61.

牛支原体单克隆抗体的制备与鉴定

任泽民^1,2, 姜勇^1,2, 巴晓亮^1,2, 胡长敏^1,2, 陈颖钰^1,3, 彭清洁^1,2, 陈焕春^1,2, 郭爱珍^1,2

1. 华中农业大学农业微生物国家重点实验室,湖北武汉 430070;
2. 华中农业大学动物医学院,湖北武汉 430070;
3. 华中农业大学动物科技学院,湖北武汉 430070

修回日期:2011-12-16 出版日期:2012-07-20 发布日期:2012-07-16
通讯作者: 郭爱珍(1965－),女,教授,主要从事兽医微生物学与免疫学的研究。E-mail:aizhen@mail.hzau.edu.cn E-mail:aizhen@mail.hzau.edu.cn
作者简介:任泽民(1984－), 男,山西人, 硕士生, 主要从事兽医微生物学与免疫学的研究。
基金资助:
农业公益性行业科研项目(201003060);现代农业(肉牛)产业技术体系专项资金(CARS-38)。

Preparation and Identification of Monoclonal Antibodies against Mycoplasma bovis

REN Ze-min^1,2, JIANG Yong^1,2, BA Xiao-liang^1,2, HU Chang-min^1,2, CHEN Ying-yu^1,3, PENG Qing-jie^1,2, CHEN Huan-chun^1,2, GUO Ai-zhen^1,2

1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;
2. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
3. College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Revised:2011-12-16 Online:2012-07-20 Published:2012-07-16

摘要/Abstract

摘要： 以牛支原体(Mycoplasma bovis)湖北分离株HB0801作为抗原免疫8周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选出了6株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞株,分别生产腹水并对单抗进行了纯化和特性鉴定。经亚型测定,这些单抗都属IgG类。腹水ELISA效价在1×10⁵~1.6×10⁶。ELISA特异性分析结果表明,6株单抗与临床分离的牛支原体菌株以及ATCC标准株PG45都显阳性反应,但与牛的其他常见病原菌如多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌等都显阴性反应。所有制备的单抗都与无乳支原体有交叉反应,其中两株单抗1A5和1C11只与无乳支原体有交叉反应,与其他支原体无交叉反应。经Western blotting验证,6株单抗分别识别牛支原体全菌蛋白中的不同条带,说明分别针对不同的蛋白抗原。这些牛支原体单克隆抗体为后期建立牛支原体检测方法及致病机理研究奠定了良好基础。

关键词: 牛支原体; 单克隆抗体; 免疫印迹; ELISA; 杂交瘤; 特异性

Abstract: 8-week-old female BALB/c mice were immunized with Mycoplasma bovis HB0801. By using the hybridoma technique, six hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies (MAbs) were identified. The ascite for the six MAbs were prepared and the characteristics of them were further studied. All of the six MAbs belonged to IgG category. The antibody titers of these MAbs ranged from 1?10⁵ to 1.6?10⁶. The specificity of these MAbs was detected by ELISA. The result suggested that all these MAbs can react with Mycoplasma bovis strains clinically isolated from China and the ATCC reference strain PG45, but they did not react with other bovine pathogenic bacteria tested such as Pasteurella multocida, Arcanobacterium pyogenes and so on. All MAbs investigated cross-reacted with Mycoplasma agalactiae which was known to be closely related to Mycoplasma bovis, prevalent in goats but not in cattle. Among them, two MAbs 1A5 and 1C11 did not exhibit further cross-reactions to other Mycoplasma species tested. In addition, Western blotting assay demonstrated that these six antibodies recognized various Mycoplasma bovis proteins. In conclusion, the MAbs prepared in this study layed the foundation for the establishment of novel detection methods for Mycoplasma bovis and studying its pathogenesis.

Key words: Mycoplasma bovis; monoclonal antibodies (MAbs); Western blotting; ELISA; hybridoma; specificity

中图分类号:

S852.62

任泽民, 姜勇, 巴晓亮, 胡长敏, 陈颖钰, 彭清洁, 陈焕春, 郭爱珍. 牛支原体单克隆抗体的制备与鉴定[J]. , 2012, 39(7): 58-61.

REN Ze-min, JIANG Yong, BA Xiao-liang, HU Chang-min, CHEN Ying-yu, PENG Qing-jie, CHEN Huan-chun, GUO Ai-zhen. Preparation and Identification of Monoclonal Antibodies against Mycoplasma bovis[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2012, 39(7): 58-61.

参考文献

1 石磊,龚瑞,尹争艳,等. 肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断[J].华中农业大学学报,2008,27(5):629~633.
2 毕丁仁,王桂枝.动物霉形体及研究方法[M]. 北京:中国农业出版社,1998.
3 李玉华.(一)实验动物支原体感染双抗体夹心ELISA方法的建立 (二)人工培养环境对肺支原体致病性和抗原性的影响. 北京:中国协和医科大学,2007.
4 辛九庆,李媛,郭丹,等.国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体[J]. 中国预防兽医学报, 2008, 30 (9): 661~664.
5 姚永进,剡根强,王静梅,等.致犊牛肺炎和关节炎牛支原体新疆株的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医,2011,38(12):76~78.
6 胡长敏,石磊,龚瑞,等.牛支原体病研究进展[J].动物医学进展,2009,30(8):73~77.
7 魏晓露,刘婧,高菁霞,等.二乙烯亚胺灭活流感病毒的效果观察[J].中国生物制品学杂志,2008,21(5):395~397.
8 J 萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔著,黄培堂等译. 分子克隆实验指南[M]. 第3版. 北京:科学出版社, 2005.
9 Adegboye D S, Rasberry U, Halbur P G,et al. Monoclonal antibody-based immunohistochemical technique for the detection of Mycoplasma bovis in formalin-fixed, paraffin-embedded calf lung tissues[J]. J Vet Diagn Invest,1995,7(2):261~265.
10 Bai Z D, Shi L, Hu C M, et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Mycoplasma bovis[J]. African Journal of Biotechnology,2011,10 (57):12333~12338.
11 Berthold E, Heller M, Pfützner H, et al. Preparation and characterization of monoclonal antibodies against Mycoplasma bovis[J]. Zentralbl Veterinarmed B,1992,39(5):353~361.
12 Nicholas R A, Ayling R D. Mycoplasma bovis: disease, diagnosis and control[J]. Res Vet Sci,2003,74(2):105~112.
13 Rasberry U, Rosenbusch R F. Membrane-associated and cytosolic species-specific antigens of Mycoplasma bovis recognized by monoclonal antibodies[J]. Hybridoma,1995,14(5):481~485.
14 Sachse K, Pfützner H, Heller M, et al. Inhibition of Mycoplasma bovis cytadherence by a monoclonal antibody and various carbohydrate substances[J]. Vet Microbiol,1993,36:307~316.

[1]	潘向英, 曾智勇, 梁海英, 汤德元, 王彬, 叶泥, 田红利, 边孟婷, 柳佳佳, 黄书. 猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(3): 1231-1240.
[2]	尹凯雯, 毛伟, 曹金山, 孙月, 董海燕, 韩凯凡, 王博, 李培锋, 张志丹, 樊宏亮, 郭宇, 赵红霞. 内蒙古地区牛呼吸道感染的主要病原菌及支原体分离鉴定及耐药性和毒力基因检测[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(3): 1328-1341.
[3]	王小格, 司煊瑛, 闫志伟, 王飞, 尤龙琪, 刘梗, 蔡茂, 梁珺珹, 梁玉秀, 杜永坤, 张改平. 非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(2): 781-791.
[4]	韩凤烨, 刘莹, 潘晨帆, 张乾义, 陈小云, 朱真, 印春生, 温永俊, 王凤雪, 杜吉革. 产气荚膜梭菌Alpha毒素突变体的表达及单克隆抗体制备[J]. 中国畜牧兽医, 2025, 52(1): 442-450.
[5]	程晶, 陈沛霖, 郭禹, 崔锦蔷, 江波, 周林宜, 刘文晓, 李焕荣, 李永清. 牛早幼粒细胞白血病蛋白的原核表达及单克隆抗体制备[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(9): 4014-4024.
[6]	唐恬, 王振, 余梦环, 徐坤, 何瑞丽, 秦田哲, 陈创夫, 马忠臣, 王勇. 牛支原体感染牛巨噬细胞对线粒体途径介导凋亡的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(8): 3625-3634.
[7]	崔锦蔷, 程晶, 江波, 周林宜, 刘文晓, 李永清, 宋勤叶. 鸡γ-干扰素的原核表达及其单克隆抗体制备与鉴定[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(7): 3008-3019.
[8]	欧云文, 潘琴, 汪洋, 代军飞, 任绍科, 张洋, 翟佳佳, 张杰. 猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(7): 3056-3066.
[9]	付明智, 李新新, 刘雪威, 李焕荣. 猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子的原核表达及单克隆抗体制备[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(6): 2556-2565.
[10]	高乐, 司朵朵, 郭磊, 陈灿, 王玮, 王健霖, 王玲玲, 李继东. 滑液囊支原体GA组件蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(6): 2621-2632.
[11]	任建乐, 林铱婷, 姬康, 谭姗姗, 陈新新, 晋怡, 王颖, 牛胜, 梁立滨, 李俊平, 赵宇军, 田文霞. A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(2): 678-688.
[12]	杨大为, 刘书怡, 蔺雅婷, 陈虎, 张洪亮, 李桂梅. 猪伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(12): 5439-5448.
[13]	张宜宸, 孙明军, 邓昌顺, 丁家波, 徐宝梁, 陈磊, 全春兰, 赵康, 范学政, 秦彤. 基于重组E2蛋白的牛病毒性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与评价[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(12): 5459-5469.
[14]	武上杰, 李佳佳, 蒋琳, 马月辉, 丁家波, 何晓红. 基于cELISA检测的绵羊抗布鲁氏菌病性状全基因组关联分析[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(10): 4191-4199.
[15]	徐浩钧, 刘颖, 梅晨, 徐彤, 利凯, 王宏俊. 基于外膜蛋白的鼻气管鸟杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2024, 51(10): 4420-4428.