猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

›› 2012, Vol. 39 ›› Issue (6): 41-46.

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

曾思遥^1,2, 张淑琼¹, 余绍华¹, 唐志玲¹, 陈瑞爱², 罗满林^1,2

1. 华南农业大学,广东广州 510642;
2. 广东大华农动物保健品股份有限公司研发中心,广东云浮 527300

收稿日期:2011-12-16 出版日期:2012-06-20 发布日期:2012-07-02
通讯作者: 罗满林(1957－),男,湖北人,博士生导师,教授,研究方向:传染病。E-mail:luoml@scau.edu.cn E-mail:luoml@scau.edu.cn
作者简介:曾思遥(1985－),男,江西人,硕士生,研究方向:预防兽医学传染病。
基金资助:
省部产学研结合重大项目(2011A090200117);广东大华农科研基金(033A201005-3)。

Establishment of TaqMan Real-time Quantitative PCR Method for Detection of PCV2

ZENG Si-yao^1,2, ZHANG Shu-qiong¹, YU Shao-hua¹, TANG Zhi-ling¹, CHEN Rui-ai², LUO Man-lin^1,2

1. South China Agricultural University, Guangzhou 510642,China;
2. Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co.,LTD.Researd and Development Center, Yunfu 527300,China

Received:2011-12-16 Online:2012-06-20 Published:2012-07-02

摘要/Abstract

摘要： 本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。

关键词: 猪圆环病毒2型; 荧光定量PCR; TaqMan探针; 标准曲线

Abstract: The research with porcine circovirus type 2 (PCV2) of the ORF2 capsid protein gene for the purpose, design and synthesis of specific primers and probes. Gene was amplified by PCR and cloned into the pMD18-T vector, screened positive plasmid standards. By quantitative PCR optimization of reaction conditions, establishment of a real-time detection of PCV2 TaqMan quantitative PCR method. The results showed that the method was specificity, the pig pseudorabies virus (PRV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), swine fever virus (CSFV) and other common diseases of the original pig detection results were negative.Compared with ordinary PCR method, the sensitivity was 100 times higher, up to 100 copies/μL; for the detection of clinical samples showed that the method can effectively detect lymph nodes, lungs and other tissues of PCV2.

Key words: porcine circovirus type 2; fluorescent quantitative PCR; TaqMan probe; standard curve

中图分类号:

S852.65^＋9.2

曾思遥, 张淑琼, 余绍华, 唐志玲, 陈瑞爱, 罗满林. 猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. , 2012, 39(6): 41-46.

ZENG Si-yao, ZHANG Shu-qiong, YU Shao-hua, TANG Zhi-ling, CHEN Rui-ai, LUO Man-lin. Establishment of TaqMan Real-time Quantitative PCR Method for Detection of PCV2[J]. , 2012, 39(6): 41-46.

参考文献

1 王忠田,杨汉春,郭鑫.规模化养猪场圆环病2型感染的流行病学调查[J].中国兽医杂志,2002,38(10):3~5.
2 白兴华,原志伟,李军民,等.TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究[J].检验检疫学刊,2009,19(5):17~20.
3 乔莉娟,王立贤,颜华.猪SP2A基因荧光定量PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2009,30(8):24~29.
4 阳成波,印遇龙,黄瑞林,等.实时定量RT-PCR的原理及方法[J].免疫学杂志,2003,19(3):145~150.
5 李坤,温国元,罗青平,等.猪圆环病毒Ⅱ型抗体间接ELISA检测方法的建立[J].华中农业大学学报,2009,28(6):710~714.
6 张锦秀,晁生玉,丁敏,等.检测猪圆环病毒2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的建立[J].中国畜牧兽医,2008,35(9):30~33.
7 欧阳松应,杨冬,欧阳红生,等.实时荧光定量 PCR 技术及其应用[J].生命的化学,2004,24(1):74~76.
8 郎洪武,王力,张广川,等.猪圆环病毒分离鉴定及猪断奶后多系统衰弱综合症的诊断[J].中国兽医科技,2001,31(3):3~4.
9 侯宇.荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].贵州农业科学,2009,37(6):29~32.
10 郭龙军,陆月华,黄立平,等.猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定[J].中国农业科学,2010,43(7):1480~1486.
11 黄立平,刘长明,危艳武,等.抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和活性单克隆抗体的制备及鉴定[J].中国预防兽医学报,2009,31(2):132~136.
12 Allan G M,Meehan B,Todd D,et al.Novel porcine circovirus from pigs with wasting disease syndrom[J].Vet Rec,1998,142:467~468.
13 Arya M,Shergill I S,Williamson M,et al.Basic principles of realtime quantitative PCR[J].Expert Rev Mol Diagn,2005,5(2):209~219.
14 Deepak S,Kottapalli K,Rakwal R,et al.Real time PCR:revolutionizing detection and expression analysis of genes[J].Curr Genomics,2007,8(4):234~251.
15 Fenaux M,Opriessnig T,Halbur P G,et al.Two amino acid mutations in the capsid protein of type 2 porcine circovirus (PCV2) enhanced PCV2 replication in vitro and attenuated the virus in vivo[J].Journal of Virology,2004,78(24):13440~13446.
16 Kawashima H,Tsunemitsu R H,et al.Effects of dexamethasone on the pathogenesis of porcine circovirus type 2 infection in piglets[J].J Comp Path,2003,129:294~302.
17 Liu J,Chen I,Kwang J.Characterization of a previously unidentified viral protein in porcine circovirus type 2 infected cells and its role in virus induced apoptosis[J].Journal of Virology,2005,79:8262~8274.
18 Mankertz A,Domingo M,Folch J M,et al.Characterization of PCV2 isolates from Spain,Germany and France[J].Virus Research,2000,66(1):65~77.
19 Meehan B,McNeilly F,Todd D,et al.Characterization of novel circovirus DNA sassociated with wasting syndrome sin pigs[J].J Gen Virol,1997,79:2171~2179.
20 Nielsen I,Vincent A,Tner B,et al.Association of lymphopenia with porcine circovirus type 2 induced post weaning multisystemic wasting syndrome PMWS[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2003,92:97~111.
21 Paton D,Ibata S J.Detection of transmissible gastroenteritis virus by RT-PCR and differentiation from porcine respiratory coronavirus[J].J Vir Met,1997,66:303~309.
22 Provenzano M,Mocellin S.Complementary techniques: validation of gene expression data by quantitative real time PCR[J].Adv Exp Med Biol,2007,593:66~73.
23 Schmittgen T D,Zakrajsek B A.Effect of experimental treatment on house keeping gene expression: validation by real-time,quantitative RT-PCR[J].J Biochem Biophys Methods,2000,46(1~2):69~81.
24 Truong C,Mahe D,Blanchard P,et al.Identification of immunorelevant ORF2 epitope from porcine circovirus type 2 as a serological marker for experimental and natural infection[J].Archives of Virology,2001,146:1197~1211.
25 Valasek M A,Repa J J.The power of real-time PCR[J].Adv Physiol Educ,2005,29(3):151~159.
26 Watzinger F,Ebner K,Lion T.Detection and monitoring of virus infections by real-time PCR[J].Mol Aspects Med,2006,27(2~3):254~298.

[1]	刘新月, 栗利芳, 王振豹, 张文亮, 张欣, 赵洪涛, 李鹏宇, 郑昊天, 肖进, 齐鹏. 猪圆环病毒2型合成肽疫苗佐剂筛选与免疫保护性研究[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(3): 1068-1080.
[2]	周文锋, 张英婕, 白一涵, 张露华, 麦金辉, 王乃东, 杨毅, 湛洋, 王东亮. 猪圆环病毒2型全基因组序列分析及Cap蛋白CTL表位预测[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(2): 656-665.
[3]	麻宝艺, 盛陈艳, 刘宏莹, 马青霞, 汪婷婷, 李健明, 时坤, 杜锐, 冷雪. BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(6): 2326-2335.
[4]	周伟, 刘旭平, 张艳敏, 彭雯娟, 赵亮, 谭文松. 无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(6): 2397-2405.
[5]	羊露露, 李安琪, 袁生, 黄良宗, 黄淑坚, 温峰, 郭锦玥. 广东省4株PCV2型分离株全基因组进化分析[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(3): 1015-1023.
[6]	吕晓楠, 徐立蒲, 张文, 王娜, 曹欢, 王小亮, 王姝, 王静波. 感染鲤浮肿病毒镜鲤的组织病理变化及病毒分布规律研究[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(3): 1077-1084.
[7]	张敬寒, 李枝兰, 韩佃刚, 何帅, 刘金华, 吕念词, 邹丰才, 柴俊, 张以芳. 稳定表达IL-10的PK-15细胞的构建及其在PCV2增殖中的应用[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(3): 1085-1095.
[8]	孙庆帅, 陈燕虹, 姚伦, 孙琪, 于学祥, 吴昊, 阮胜男, 雷铭楷, 严伟东, 何启盖. 猪圆环病毒2型和3型混合感染引起的母猪繁殖障碍诊治[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(10): 3982-3993.
[9]	张军芳, 孙建富, 孙斌, 唐琳, 王英, 王恩泽, 崔岩, 李强, 严昌国, 李香子. 延边牛PPARγ基因的克隆及生物信息学分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(8): 2695-2704.
[10]	苗曼宁, 郭益文, 胡德宝, 曾雨晗, 李新, 张林林, 丁向彬, 郭宏. MSTN基因编辑牛肌肉转录组测序及生物信息学分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(7): 2271-2281.
[11]	曹迷霞, 关静渊, 杨剑, 王新蕊, 王玲力, 宾秀娟, 王可菲, 黄海资, 胡庭俊. 西番莲多糖提取物对猪圆环病毒2型感染RAW264.7细胞氧化应激的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(6): 2238-2246.
[12]	李恒, 字向东. 牦牛跨膜附睾蛋白1基因的克隆及其在卵丘卵母细胞复合体中的表达分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(4): 1284-1293.
[13]	李建梅, 季正剑, 刘梅, 沈欣悦, 程旭, 俞燕, 戴亚斌. 藏鸡和隐性白羽鸡感染柔嫩艾美耳球虫后免疫相关基因的表达变化分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(4): 1440-1448.
[14]	高映雪, 薛瑞, 林敏, 胡换仪, 刘昌锦, 万文忠, 罗锋, 邓舜洲. 表达猪圆环2型的多拷贝P28-Cap重组猪痘病毒的构建及表达量分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(3): 818-828.
[15]	陈磊, 袁枫, 贺三刚, 玛依拉, 李文蓉. 绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(2): 425-432.