潮霉素抗性基因筛选标记质粒的构建及LL37的表达

›› 2012, Vol. 39 ›› Issue (4): 86-90.

潮霉素抗性基因筛选标记质粒的构建及LL37的表达

徐义兵¹, 刘娜², 黄毓茂¹

1. 华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;2. 肇庆市农业学校,广东肇庆 526070

收稿日期:1900-01-01 修回日期:2011-10-11 出版日期:2012-04-20 发布日期:2012-04-20
通讯作者: 黄毓茂

Construction of a Hygromycin Phosphotranferase as a Selectable Marker Plasmid and the Expression of LL37

XU Yi-bing¹, LIU Na², HUANG Yu-mao¹

1. College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2. Zhaoqing Agricultural School,Zhaoqing 526070,China

Received:1900-01-01 Revised:2011-10-11 Online:2012-04-20 Published:2012-04-20

摘要/Abstract

摘要： 为了实现以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)为选择标记的质粒在毕赤酵母中高效表达抗菌肽LL37,在pGAPZαA质粒的基础上,通过EcoRⅤ、BamHⅠ双酶切将Zeocin抗性基因替换成潮霉素磷酸转移酶基因,获得的表达质粒命名为pGAPHαA。根据LL37氨基酸序列,通过毕赤酵母密码子偏嗜性改造,合成的LL37基因片段克隆到pGAPHαA质粒中,获得重组分泌型表达质粒pGAPHαA-LL37,线性化后电击转化毕赤酵母SMD1168,经潮霉素B筛选阳性转化子。72 h表达上清LL37蛋白含量约为167 μg /mL,表达产物耐热性好,对大肠杆菌DH5α、猪链球菌最小抑菌浓度分别为2.94、7.06 μg/mL。

关键词: 潮霉素磷酸转移酶基因; pGAPHαA; 抗菌肽LL37; 毕赤酵母

Abstract: In order to construct a plasmid with the hygromycin phospotransferase gene as a selectable marker to express antimicrobial peptide LL37 in Picha pastori,Zeocin resistance gene in pGAPZαA was replaced by the hygromycin phospotransferase gene through EcoRⅤ, BamHⅠ restriction enzyme digestion,the new plasmid was named as pGAPHαA. LL37 gene was designed and synthesized to include the partiality codons of P.pastoris,then it was cloned into the pGAPHαA vector and transformed into P.pastoris SMD1168 by electroporation. The transformants were screened with hygromycin B. Up to 167 mg/L LL37 was produced in culture medium. Expression product of heat resistance. Agrose diffusion assay showed that LL37 had potent antibacterial activity against both Gram-negative and Gram-postive bacteria,with MIC of 2.94 μg/mL, 7.06 μg/mL against E.coli DH5α and Streptococcus suis,respectively.

Key words: hygromycin phospotransferase gene; pGAPHαA; antimicrobial peptide LL37; P.pastoris

中图分类号:

徐义兵;刘娜;黄毓茂. 潮霉素抗性基因筛选标记质粒的构建及LL37的表达[J]. , 2012, 39(4): 86-90.

XU Yi-bing;LIU Na;HUANG Yu-mao. Construction of a Hygromycin Phosphotranferase as a Selectable Marker Plasmid and the Expression of LL37[J]. , 2012, 39(4): 86-90.

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