牛副结核分枝杆菌实时荧光定量 PCR 检测方法的建立

›› 2012, Vol. 39 ›› Issue (10): 22-26.

牛副结核分枝杆菌实时荧光定量 PCR 检测方法的建立

王素华¹, 王忠才¹, 李孝军², 杜爱芳³

1. 温州出入境检验检疫局,浙江温州 325027;
2. 舟山出入境检验检疫局,浙江舟山 316000;
3. 浙江大学动物预防医学研究所,浙江杭州 310029

收稿日期:2012-03-13 出版日期:2012-10-20 发布日期:2012-10-19
作者简介:王素华(1975-),女,山东人,兽医师,硕士,主要从事动物及动物产品检疫工作。
基金资助:
浙江出入境检验检疫局立项项目(2011ZK019)。

Development of Real-time Fluorescence Quantitative PCR Assay for Detection of Bovine Mycobacterium paratuberculosis

WANG Su-hua¹, WANG Zhong-cai¹, LI Xiao-jun², DU Ai-fang³

1. Wenzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Wenzhou 325027, China;
2. Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan 316000, China;
3. Institute of Preventive Veterinary Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China

Received:2012-03-13 Online:2012-10-20 Published:2012-10-19

摘要/Abstract

摘要： 根据GenBank上公布的牛副结核分枝杆菌C-2染色体的ISMav2基因保守区域序列设计合成1对特异性引物,建立了一套SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测牛副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)的方法。以实验室构建的牛副结核分枝杆菌pMD-ISMav2阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线,其相关系数为0.999。以构建的标准品为模板,进行了特异性和敏感性试验。结果显示,该方法检测布氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌DNA均为阴性;最低可检测到相当于每微升1.96×10¹拷贝数的标准品阳性质粒。本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感和快速等优点,可用于牛副结核杆菌病的监测。

关键词: 牛副结核分枝杆菌; 实时荧光定量PCR; 检测

Abstract: According to the published sequences of bovine Mycobacterium paratuberculosis in GenBank, a pair of primers were designed and synthesized for the C-2 chromosome(ISMav2)gene of Mycobacterium paratuberculosis, and a SYBR-GreenⅠfluorescent Real-time quantitative PCR assay was developed. The positive standard plasmid pMD-ISMav2 were used as quantitative template to make the standard curves by optimizing the reaction conditions, the correlation coefficient (R²) was 0.999. By using the positive standard as template, specificity and sensitivity were tested. According to the experiment, all negative controls such as Brucella, Escherichia coli, Salmonella and Streptococcus showed negative detection. By sensitivity analysis, the Real-time PCR indicated that a minimum of 1.96×10¹ copies of plasmid DNA was detected. As a result of the specificity and sensitivity of the assay with a relatively rapid and simple procedure, the Real-time PCR can be used as a routine assay for the diagnosis of Mycobacterium paratuberculosis.

Key words: Mycobacterium paratuberculosis; Real-time fluorescence quantitative; detection

中图分类号:

S854.4⁺3

王素华, 王忠才, 李孝军, 杜爱芳. 牛副结核分枝杆菌实时荧光定量 PCR 检测方法的建立[J]. , 2012, 39(10): 22-26.

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