体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板

›› 2010, Vol. 37 ›› Issue (4): 43-46.

体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板

孙军峰^1，2，刘华雷²，张维²，王志亮²

（1.青岛农业大学，青岛 266109； 2.中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032）

收稿日期:1900-01-01 修回日期:1900-01-01 出版日期:2010-04-20 发布日期:2010-04-20
通讯作者: 王志亮

Preparation of Standard Positive Template with Transcription in Vitro for Real-time Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) for the Detection of Newcastle Disease Virus

SUN Jun-feng^1，2，LIU Hua-lei²，ZHANG Wei²，WANG Zhi-liang²

(1.Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109,China; 2.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032,China）

Received:1900-01-01 Revised:1900-01-01 Online:2010-04-20 Published:2010-04-20
Contact: WANG Zhi-liang

摘要/Abstract

摘要： 本研究针对新城疫病毒M基因设计了1对荧光定量RT-PCR引物和Taqman探针，在上游引物的5′端引入T7启动子，采用RT-PCR方法获得了体外转录模板，并对转录产物RNA的浓度及D值进行了测定。线性试验和特异性试验结果表明，该模板具有良好的线性范围和特异性，模板稀释度为2.95×10⁴～2.95×10⁸拷贝/ L时，相关系数为0.998。该模板稳定性好，-80 ℃保存30 d后无显著变化。浓度为2.95×10⁴～2.95×10⁸拷贝/μL的标准品的变异系数分别为0.20%、0.28%、1.00%、0.54%、0.52%，表明以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性。

关键词: 新城疫病毒; 体外转录; 一步法荧光定量RT-PCR

Abstract: Primers and probe for qRT-PCR were designed based on the matrix protein gene sequence of Newcastle disease virus(NDV)，and T7 promoter was added to the 5’ end of the forward primer. RT-PCR was used to get the template for transcription in vitro，and the concentration and the D value of the RNA were determined. The results of linear and specific test indicated that the template showed good linearity and specificity.The correlation coefficient was 0.998 when the template was diluted to 2.95×10⁴ to 2.95×10⁸copies/μL. Storing at -80 ℃,the template still worked well after 30 days. And the coefficient of variation value of 2.95×10⁴ to 2.95×10⁸ copies/μL standard positive template were 0.20%, 0.28%, 1.00%, 0.54% and 0.52% respectively，showing an excellent repetitiveness of the template. tative reverse transcriptase PCR

Key words: Newcastle disease virus; in vitro transcription; one-step real-time quantitative reverse transcriptase PCR

中图分类号:

S852.65⁺9.5

孙军峰;刘华雷;张维;王志亮. 体外转录法制备新城疫病毒荧光定量RT-PCR标准阳性模板[J]. , 2010, 37(4): 43-46.

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