猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N基因重组表达载体的构建及稳定表达细胞系的建立

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.08.007

《中国畜牧兽医》 ›› 2017, Vol. 44 ›› Issue (8): 2261-2268.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.08.007

猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N基因重组表达载体的构建及稳定表达细胞系的建立

唐青海^1,2,3, 杨海^1,2,3, 黎露^1,2,3, 陈果亮^1,2,3, 何丽芳^1,2,3, 刘最^1,2,3, 王芳宇^1,2,3

1. 衡阳师范学院生命科学与环境学院, 衡阳 421008;
2. 衡阳师范学院生物药物研究所, 衡阳 421008;
3. 衡阳师范学院湖南益豚生态农业有限责任公司联合研究中心, 衡阳 421008

收稿日期:2017-01-19 出版日期:2017-08-20 发布日期:2017-08-18
通讯作者: 唐青海 E-mail:qinghaitang109@126.com
作者简介:唐青海(1982-),男,湖南祁阳人,博士,助理研究员,硕士生导师,研究方向:生物制药与疫苗工程;杨海(1978-),男,湖南浏阳人,博士,副教授,硕士生导师,研究方向:生物药物,E-mail:270749499@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金青年基金（31101837）；衡阳师范学院引进人才专项项目（16D20）；湖南省教育厅优秀青年项目（17B038）

Construction of Recombinant Expression Vector and Establishment of Stable Expression Cell Line of N Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain CH-HuN1301

TANG Qing-hai^1,2,3, YANG Hai^1,2,3, LI Lu^1,2,3, CHEN Guo-liang^1,2,3, HE Li-fang^1,2,3, LIU Zui^1,2,3, WANG Fang-yu^1,2,3

1. College of Life Sciences and Environment, Hengyang Normal University, Hengyang 421008, China;
2. Institute of Biological Medicine, Hengyang Normal University, Hengyang 421008, China;
3. Joint Research Centre of Hunan Yi-tun Ecological Agriculture LLC and Hengyang Normal University, Hengyang 421008, China

Received:2017-01-19 Online:2017-08-20 Published:2017-08-18

摘要/Abstract

摘要：

本研究旨在建立猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV） CH-HuN1301株N蛋白稳定表达细胞系。采用RT-PCR扩增PEDV新流行毒株CH-HuN1301株N基因，分别克隆至原核表达载体pET28a和真核表达载体pEGFP-C1构建重组表达载体，所测定的序列采用Mega 5.0软件进行进化分析。将原核表达的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，重组真核表达载体pEGFP-PEDV-N转染HEK293细胞，经用G418筛选获得稳定的表达细胞系。荧光倒置显微镜观察细胞荧光，免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）检测N蛋白的表达。结果表明，PEDV HuN1301-14毒株N基因大小为1 323 bp，原核表达重组N蛋白分子质量约60 ku，其多克隆抗体与PEDV呈特异性反应，荧光倒置显微镜观察和IPMA检测结果显示N蛋白在HEK293细胞中稳定表达。该细胞系的建立为进一步研究PEDV的诊断方法提供了基础材料。

关键词: 猪流行性腹泻病毒; CH-HuN1301毒株; N基因; 稳定细胞系

Abstract:

This study was aimed to construct stable cell line expressing N protein coded by porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) strain CH-HuN1301. N gene of this virus strain was amplified by RT-PCR, which was then cloned into prokaryotic expression vector pET28a and eukaryotic expression vector pEGFP-C1,respectively. Recombinant plasmids were sequenced and analyzed by software Mega 5.0. To prepare polyclonal antibody of N protein, the prokaryotic expression recombinant N protein was used as antigen to immunize rabbits. HEK293 transfected with recombinant eukaryotic expression plasmids pEGFP-PEDV-N was selected by G418 to produce a stable cell line which then was identified by immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) and fluorescence observation. Results showed that, the N gene of PEDV strain CH-HuN1301 was 1 323 bp, molecular weight of recombinant prokaryotic expressing N protein was about 60 ku, prepared polyclonal antibody against N protein showed wonderful reactivity with PEDV propagated in Vero cells, recombinant eukaryotic expressing N protein was positively detected in the established stable cell line by IPMA and fluorescence observation. This stable cell line provided foundation for the research in PEDV diagnosis methods.

Key words: porcine epidemic diarrhea virus (PEDV); CH-HuN1301; N gene; stable cell line

中图分类号:

S852.65

唐青海, 杨海, 黎露, 陈果亮, 何丽芳, 刘最, 王芳宇. 猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N基因重组表达载体的构建及稳定表达细胞系的建立[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(8): 2261-2268.

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