东方马脑脊髓炎病毒TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2015.11.005

›› 2015, Vol. 42 ›› Issue (11): 2850-2855.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2015.11.005

东方马脑脊髓炎病毒TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

郑小龙, 王群, 张晓文, 孙明君, 朱来华

山东出入境检验检疫局, 青岛 266002

收稿日期:2015-04-02 出版日期:2015-11-20 发布日期:2015-11-26
通讯作者: 郑小龙 E-mail:zhengxl612@163.com
作者简介:郑小龙(1979-),男,山东平邑人,硕士,高级兽医师,从事进出境动物检疫和研究
基金资助:
国家质检总局科技项目(2014IK240)

Establishment of TaqMan MGB Real-time RT-PCR Assay for Detection of Eastern Equine Encephalitis Virus

ZHENG Xiao-long, WANG Qun, ZHANG Xiao-wen, SUN Ming-jun, ZHU Lai-hua

Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China

Received:2015-04-02 Online:2015-11-20 Published:2015-11-26

摘要/Abstract

摘要： 本试验通过RT-PCR从东方马脑脊髓炎病毒(EEEV)中扩增得到128 bp的特异性保守序列,将其克隆到pMD20-T载体中,并进行体外转录,制备标准品cRNA。以10倍系列稀释的cRNA为模板,进行TaqMan MGB荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线,建立了EEEV TaqMan MGB荧光定量RT-PCR的检测方法。进一步对建立的方法进行了特异性和敏感性试验。结果表明,建立的TaqMan MGB荧光定量RT-PCR最低可检测10拷贝/μL的cRNA;且与阴性对照及马鼻肺炎病毒(EHV-1)、马动脉炎病毒(EAV)、马流感病毒(EIV,H3N8)、西尼罗病毒(WNV)、西方马脑脊髓炎病毒(WEEV)和日本马脑炎病毒(JEV)均不发生交叉反应。所制作的标准曲线在1.0×10¹~1.0×10⁶拷贝/μL浓度范围内有极好的线性关系,相关系数为0.998,标准曲线方程式为y=40-3.35logx;与常规RT-PCR相比,该方法更加快速,特异性和敏感性更高,灵敏度为常规RT-PCR方法的100倍。试验结果表明,建立了一种快速、高效、特异、敏感的EEEV TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法。

关键词: 东方马脑脊髓炎病毒; TaqMan MGB; 荧光定量RT-PCR

Abstract: The 128 bp specific and consensus sequence of Eastern equine encephalitis virus (EEEV) was amplified by RT-PCR and cloned into pMD20-T vector,and conducted in vitro transcription to prepare standard cRNA.10 fold serial diluted cRNA were used as standard templates for RT-PCR to quantify the genomic copy number of EEEV.We developed a TaqMan MGB Real-time RT-PCR to detect EEEV.Sensitivity assay result showed that the established TaqMan MGB Real-time RT-PCR could detect 10 copies/μL cRNA.The specificity assay exhibited that negative control and the other equine pathogens (EHV-1,EAV,EIV H3N8,WNV,WEEV and JEV) could not be detected.A good linear correlation was demonstrated in the standard curve for TaqMan MGB Real-time RT-PCR within the range of 1.0×10¹ to 1.0×10⁶ copies/μL with a correlation coefficient of 0.998 and a standard curve of y=40-3.35logx.The results demonstrated that TaqMan MGB Real-time RT-PCR was 100 fold more sensitive than conventional RT-PCR.The results suggested that the convenient,specific,high performance and sensitive method of TaqMan MGB Real-time RT-PCR for the detection of EEEV was successfully established in this study.

Key words: Eastern equine encephalitis virus (EEEV); TaqMan MGB; Real-time RT-PCR

中图分类号:

郑小龙, 王群, 张晓文, 孙明君, 朱来华. 东方马脑脊髓炎病毒TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. , 2015, 42(11): 2850-2855.

ZHENG Xiao-long, WANG Qun, ZHANG Xiao-wen, SUN Ming-jun, ZHU Lai-hua. Establishment of TaqMan MGB Real-time RT-PCR Assay for Detection of Eastern Equine Encephalitis Virus[J]. , 2015, 42(11): 2850-2855.

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