3种猪细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2015.01.004

›› 2015, Vol. 42 ›› Issue (1): 24-31.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2015.01.004

3种猪细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

王凤雪¹, 黄双², 刘莹¹, 杨勇¹, 孙娜¹, 朱洪伟¹, 张淑琴¹, 程世鹏¹, 温永俊¹

1. 中国农业科学院特产研究所, 特种经济动物分子生物学国家重点实验室, 长春 130112;
2. 沈阳农业大学, 沈阳 110866

收稿日期:2014-07-02 出版日期:2015-01-20 发布日期:2015-02-06
通讯作者: 温永俊 E-mail:yongjunwen@126.com
作者简介:王凤雪(1978-), 女, 山东人, 博士, 研究方向:动物疫苗与分子免疫学
基金资助:
国家高技术发展计划项目(国家"863"计划项目)(2011AA10A213);吉林省科技发展计划项目(20121823)

Establishment and Application of Real-time Fluorescent Quantitative RT-PCR Method of the Detection of Three Swine Cytokines

WANG Feng-xue¹, HUANG Shuang², LIU Ying¹, YANG Yong¹, SUN Na¹, ZHU Hong-wei¹, ZHANG Shu-qin¹, CHENG Shi-peng¹, WEN Yong-jun¹

1. State Key Laboratory for Molecular Biology of Special Economic Animals, Institute of Special Wild Economic Animals and Plants, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China;
2. Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

Received:2014-07-02 Online:2015-01-20 Published:2015-02-06

摘要/Abstract

摘要： 为建立猪细胞因子SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中3种重要的猪细胞因子即猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、α-干扰素(interferon α,IFN-α)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因.将3种基因克隆至pMD18-T载体上,得到各自阳性克隆质粒,以3种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验.结果表明,当标准品稀释度为1×10¹~1×10⁶ 拷贝/μL时,3种基因的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均≥0.992.熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好.应用建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92株免疫的30日龄猪外周血单核细胞(PBMC)中IL-12、IFN-α和TNF-α表达量进行检测,结果发现,免疫了PRRSV TJM-F92株的猪PBMC细胞内3种细胞因子表达量均极显著升高(P< 0.01).研究结果为IL-12、IFN-α和TNF-α的定量分析提供了技术平台.

关键词: 猪; 细胞因子; SYBR Green Ⅰ; 实时荧光定量RT-PCR

Abstract: In order to establish the assay of SYBR Green Ⅰ Real-time fluorescent quantitative RT-PCR for detecting three important swine cytokines IL-12, IFN-α and TNF-α.Three pairs of specific primers were designed according to the sequence of IL-12, IFN-α and TNF-α from GenBank to amplify the objective genes.The three genes were respectively cloned to the pMD18-T vector.The corresponding plasmids were identified by sequencing, and they were then used as quantitative template to construct the standard curve and to analyze the melting curve, detection sensitivity, specificity and repeatability.The results showed that Ct value of the three genes had good linear relationship (R²≥0.992) with the dilution ranging from 1×10¹ to 1×10⁶ copies/μL.The melting curve displayed a single peak and good repeatability.The established assay was used to detect the transcriptional level of IL-12, IFN-α and TNF-α mRNA in the swine PBMC inoculated PRRSV TJM-F92.The results indicated that mRNA levels of IL-12, IFN-α and TNF-α in the swine PBMC inoculated PRRSV TJM-F92 were all significantly increased (P< 0.01).The research provides the platform for quantitative analysis of swine cytokine IL-12, IFN-α and TNF-α.

Key words: swine; cytokines; SYBR Green Ⅰ; Real-time fluorescent quantitative RT-PCR

中图分类号:

S828

王凤雪, 黄双, 刘莹, 杨勇, 孙娜, 朱洪伟, 张淑琴, 程世鹏, 温永俊. 3种猪细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. , 2015, 42(1): 24-31.

WANG Feng-xue, HUANG Shuang, LIU Ying, YANG Yong, SUN Na, ZHU Hong-wei, ZHANG Shu-qin, CHENG Shi-peng, WEN Yong-jun. Establishment and Application of Real-time Fluorescent Quantitative RT-PCR Method of the Detection of Three Swine Cytokines[J]. , 2015, 42(1): 24-31.

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