CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2016.01.005

›› 2016, Vol. 43 ›› Issue (1): 31-38.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2016.01.005

CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究

李晓敏¹, 任红艳², 毕延震², 刘西梅², 郑新民², 吴民耀¹

1. 陕西师范大学生命科学学院, 西安 710119;
2. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所, 动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室, 武汉 430064

收稿日期:2015-07-24 出版日期:2016-01-20 发布日期:2016-01-23
通讯作者: 任红艳, 吴民耀 E-mail:renhongyan507@163.com;minyaowu@snnu.edu.cn
作者简介:李晓敏(1989-),女,山西忻州人,硕士,研究方向:发育生物学,E-mail:xiaominli2182@163.com
基金资助:
国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08010-003、2014ZX08006-003);湖北省农业科技创新中心课题(2011-620-001-003);湖北省农业科学院青年基金(2014NKYJJ02)

Study on Detection of Pig SST Gene Site-directed Modification Activity by CRISPR/Cas9 System in vitro

LI Xiao-min¹, REN Hong-yan², BI Yan-zhen², LIU Xi-mei², ZHENG Xin-min², WU Min-yao¹

1. College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119, China;
2. Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding of Hubei Province, Institute of Animal and Veterinary Sciences, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China

Received:2015-07-24 Online:2016-01-20 Published:2016-01-23

摘要/Abstract

摘要： 本试验旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法检测猪生长抑素(SST)基因定点修饰靶点的活性。试验设计5个长20 bp的单链导向RNA(sgRNA),即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列连接到可同时表达Cas9和sgRNA的质粒中,挑选正确克隆的质粒作为模板进行体外转录形成SST-sgRNA。利用CRISPR/Cas9体外酶切含靶点的DNA片段,根据酶切条带的灰度换算成sgRNA活性。结果显示目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入到质粒中且序列正确,以质粒为模板体外转录SST-sgRNA成功。靶位点经Cas9蛋白酶切后与标准sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比较,确定靶点SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性较高,可为在细胞水平、胚胎水平做基因定点修饰提供依据。

关键词: 猪; 生长抑素基因; Cas9酶; 单链导向RNA(sgRNA); 体外转录

Abstract: This study was aimed to detect the targets activities which were modified in pig SST gene through the CRISPR/Cas9 enzyme digestion method in vitro.Five 20 bp sgRNAs SST-sgRNA-g1, SST-sgRNA-g2, SST-sgRNA-g3, SST-sgRNA-g4 and SST-sgRNA-g5 of SST were designed.Oligonucleotide sequences of sgRNA were chemically synthesized, and then inserted into linearized plasmid which could express Cas9 and sgRNA together.Then, the correct sgRNA plasmids were selected as a template for transcription of SST-sgRNA in vitro.Target DNA fragments were digested by CRISPR/Gas9in vitro and then the gray bands of enzyme digestion were converted into sgRNA activity.The results indicated that the target nucleotide sequences were successfully inserted into the expected sites of vector and sequences were correct.The vector was successfully transcribed into sgRNA in vitro.It showed that compared with standard sgRNA1 and sgRNA2 enzyme activity, the target SST-sgRNA-g1, SST-sgRNA-g4 and SST-sgRNA-g5 had high activities, they could provide basis for the site-directed modification of gene in cell and embryo.

Key words: pig; SST gene; Cas9 enzyme; single-guide RNA(sgRNA); transcription in vitro

中图分类号:

李晓敏, 任红艳, 毕延震, 刘西梅, 郑新民, 吴民耀. CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究[J]. , 2016, 43(1): 31-38.

LI Xiao-min, REN Hong-yan, BI Yan-zhen, LIU Xi-mei, ZHENG Xin-min, WU Min-yao. Study on Detection of Pig SST Gene Site-directed Modification Activity by CRISPR/Cas9 System in vitro[J]. , 2016, 43(1): 31-38.

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CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究

Study on Detection of Pig SST Gene Site-directed Modification Activity by CRISPR/Cas9 System in vitro

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