犬瘟热病毒血凝蛋白在昆虫细胞中的表达与抗原性分析

中国畜牧兽医

犬瘟热病毒血凝蛋白在昆虫细胞中的表达与抗原性分析

全传松¹，姜骞¹，于作¹，李博韬¹^，2，李连峰^{1，曲连东¹}

1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001；2.东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨 150030

收稿日期:2014-04-08 出版日期:2014-08-20 发布日期:2014-08-22
通讯作者: 曲连东（1964—），男，研究员，博士生导师。E-mail: qld@hvri.ac.cn
作者简介:全传松（1988—），男，山东人，硕士，研究方向: 分子病毒学。
基金资助:
国家科技支撑计划（2013BAK11B01-31）。

Expression of Hemagglutinin of Canine Distemper Virus in the Insect Cell and its Antigenic Analysis

QUAN Chuan-song¹, JIANG Qian¹, YU Zuo¹, LI Bo-tao¹^，2, LI Lian-feng¹, QU Lian-dong¹

1. State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China; 2. College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

Received:2014-04-08 Online:2014-08-20 Published:2014-08-22

摘要/Abstract

摘要： 为获得具有天然构象及良好抗原性的犬瘟热病毒（CDV）血凝蛋白（H），本研究以HLJ2-07毒株为模板，利用RT-PCR方法扩增出H基因，将其克隆到pFastBac^TMHTA载体中，利用大肠杆菌DH10Bac^TM同源重组构建穿梭质粒reBACmid-rH，将重组穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞，进行杆状病毒表达。利用Western blotting对获得的重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。同时，利用在线网站与软件对CDV H蛋白进行B细胞表位分析预测。结果显示，在杆状病毒系统中表达的H蛋白能与His-tag单克隆抗体及CDV阳性血清发生特异性反应，表明该蛋白成功表达，且具有良好的反应原性；用Swiss-model同源建模软件及B细胞表位预测软件，预测H蛋白可能具有的B细胞表位有5处，分别是175—195、240—250、365—380、480—508及526—555。本研究获得了具有天然构象及良好抗原性的CDV重组H蛋白，可为诊断试剂开发、单克隆抗体制备及表位筛选等工作奠定基础。

关键词: 犬瘟热病毒; 血凝蛋白; 杆状表达系统; B细胞表位

Abstract: To maintain the native conformation and antigenicity of hemagglutinin （H） of canine distemper virus, the H gene which referred to HLJ2-07 strains was accurately amplified by RT-PCR and cloned into pFastBac^TMHTA vector. The recombinant plasmid was successfully transformed into E.coli DH10Bac^TM competent cell and constructed shuttle vector, which was transfected into Sf9 cell to save baculovirus expressing destined protein. To determine the antigenicity of recombinant protein, Western blotting analysis was used to detect the interesting protein. Furthermore, the identification and characterization of B cell epitopes were predicted and analyzed by related software and online websites. The result demonstrated that the fusion protein generated by recombinant baculovirus was reacted with both anti-His tag monoclonal antibodies and canine distemper virus positive serum by Western blotting test, which showed that this protein had sufficient antigenicity. In addition, B cell epitopes were selected by between Swiss-model and online websites for consistent sequences to improve predictive accuracy, whereas the possible sites were 175 to 195, 240 to 250, 365 to 380, 480 to 508 and 526 to 555. These efforts served as a strong foundation for the development of diagnostic kits，the production of monoclonal antibodies and selection of protein epitopes.

Key words: canine distemper virus; hemagglutinin protein; baculovirus expression system; B cell epitopes

全传松，姜骞，于作，李博韬，李连峰，曲连东. 犬瘟热病毒血凝蛋白在昆虫细胞中的表达与抗原性分析[J]. 中国畜牧兽医.

QUAN Chuan-song, JIANG Qian, YU Zuo, LI Bo-tao, LI Lian-feng, QU Lian-dong. Expression of Hemagglutinin of Canine Distemper Virus in the Insect Cell and its Antigenic Analysis[J]. .

参考文献

1 马艳平，张杰，陈豪泰，等. 副猪嗜血杆菌S-核糖基高半胱氨酸酶基因序列分析与推导蛋白三维结构的分子模拟［J］. 中国兽医学报，2011，31(1)：40～43. 2 申会刚，商绍彬，许立场，等. 犬瘟热病毒的分子生物学及诊断［J］. 浙江畜牧兽医，2006，5：15～16. 3 曲连东，蒋良丰，刘家森，等. 仙台病毒F基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达及抗原性分析［J］. 中国预防兽医学报，2010，32(5)：347～350. 4 袁颖烁，宋菲菲，张乐萃，等. 犬瘟热病毒H蛋白的原核表达及免疫原性的初步鉴定［J］. 中国畜牧兽医，2013，40(4)：40～43. 5 梁亮, 陈寅, 卢亦愚, 等. 麻疹病毒血凝素基因原核表达与抗原性鉴定［J］. 中国疫苗和免疫, 2009(2): 108～111. 6 梅胜尧，孙宝海，白文霞，等. 犬瘟热的诊断［J］. 中国畜牧兽医，2012，39(4)：193～195. 7 葛艳华. Asia-1型犬瘟热病毒分离株H蛋白免疫原性分析及重组犬腺病毒2型的构建［D］. 哈尔滨：东北农业大学，2009. 8 Curran M D, Clarke D K, Rima B K, et al. The nucleotide sequence of the gene encoding the attachment protein H of canine distemper virus［J］. J Gen Virol, 1991, 72(2): 443～447. 9 Hirama K, Togashi K, Wakasa C, et al. Cytotoxic T-lymphocyte activity specific for hemagglutinin (H) protein of canine distemper virus in dogs［J］. J Vet Med Sci, 2003, 65(1): 109～112. 10 Pardo M C, Bauman J E, Mackowiak M, et al. Protection of dogs against canine distemper by vaccination with a canarypox virus recombinant expressing canine distemper virus fusion and hemagglutinin glycoproteins［J］. Am J Vet Res, 1997, 58(8): 833～836. 11 Seki F, Ono N, Yamaguchi R, et al. Efficient isolation of wild strains of canine distemper virus in Vero cells expressing canine SLAM (CD150) and their adaptability to marmoset B95a cells［J］. J Virol, 2003, 77(18): 9943～9950. 12 Yoshida E, Shin Y S, Iwatsuki K, et al. Epitopes and nuclear localization analyses of canine distemper virus nucleocapsid protein by expression of its deletion mutants［J］. Vet Microbiol, 1999, 66(4): 313～320. 13 Zhao J J, Yan X J, Chai X L, et al. Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of canine distemper virus strains detected from breeding foxes, raccoon dogs and minks in China［J］. Veterinary Microbiology, 2010, 140(1～2): 34～42.

[1]	赵静, 褚颖, 罗均, 郭霄峰. 嵌合犬瘟热病毒H基因的重组狂犬病病毒的构建及免疫原性研究[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(12): 4776-4785.
[2]	刘健, 白艺兰, 鞠厚斌, 潘子豪, 俞向前, 杨显超, 朱晓英, 葛菲菲, 葛杰, 于讳茹, 陶田谷晟, 王建, 赵洪进. 犬瘟热病毒SH202003株全基因组序列分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(7): 2559-2568.
[3]	王召阳, 蒋亚君, 刘雪婷, 林伟东, 鑫婷, 侯绍华, 郭晓宇, 朱鸿飞, 贾红. 抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(6): 1685-1693.
[4]	于泽坤, 段笑笑, 只勇, 栾志舫, 单学强. 稳定表达犬瘟热病毒Nectin4受体的Vero细胞系构建[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(10): 3334-3342.
[5]	陈美荣, 林伟东, 宋天琪, 鑫婷, 郭晓宇, 黄克和, 贾红. CDV强毒BJ16B2株H基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(8): 2041-2048.
[6]	赵雪丽, 刘毅, 班付国, 闫若潜, 王华俊, 王淑娟, 马震原, 王东方. 犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(8): 2086-2094.
[7]	张昕, 黄坚, 张萍, 杨晓农. 成都地区宠物犬感染犬瘟热病毒和犬呼吸道冠状病毒的分子流行病学调查[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(2): 486-492.
[8]	刘莉, 郝福星, 袁维峰, 封家旺. 犬瘟热病毒V蛋白的表达、鉴定及亚细胞定位[J]. 《中国畜牧兽医》---唯一指定的官方网站, 2016, 43(7): 1723-1728.
[9]	孙彦刚, 赵建军, 白雪, 牛登云, 邵西群, 胡博, 刘昊, 张海玲, 张蕾, 王洋, 马凡舒, 闫喜军. 水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒F蛋白信号肽区基因克隆及遗传变异分析[J]. , 2015, 42(4): 838-846.
[10]	王西西, 王凤雪, 程世鹏, 温永俊. 犬瘟热病毒感染机制及其诊断方法研究进展[J]. 《中国畜牧兽医》---唯一指定的官方网站, 2015, 42(3): 757-763.
[11]	庄金秋，梅建国，王金良，张倩，沈志强，丁壮. 水貂犬瘟热病毒LD-1株的分离与鉴定[J]. 中国畜牧兽医, 2014, 41(4): 226-232.
[12]	孙园园，赵鹏，刘骏，王云，钱科. 犬瘟热—犬冠状病毒双重PCR诊断方法的建立及初步应用[J]. 中国畜牧兽医, 2014, 41(3): 99-103.
[13]	孙建涛, 侯绍华, 于萍, 朱鸿飞, 梁欠, 郝志明. 基于甲病毒复制子的犬瘟热核酸疫苗的构建及表达性研究[J]. , 2013, 40(9): 96-100.
[14]	庄金秋, 梅建国, 姚春阳, 沈志强, 丁壮. 犬瘟热病毒免疫蛋鸡血清抗体与卵黄抗体消长规律的研究[J]. , 2013, 40(9): 214-217.
[15]	袁维峰, 贾红, 于萍萍, 侯绍华, 郭晓宇, 史利军, 赵占中, 朱鸿飞. 犬瘟热病毒截短P蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[J]. , 2013, 40(4): 22-25.