猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

›› 2014, Vol. 41 ›› Issue (12): 56-61.

猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

范斌¹, 许文花¹, 韩建强², 马志亮¹, 胡骑³, 信爱国³, 张以芳¹

1. 云南农业大学动物科学技术学院, 云南昆明 650201;
2. 玉溪农业职业技术学院, 云南玉溪 653106;
3. 云南省畜牧兽医科学院, 云南省热带亚热带动物病毒重点实验室, 云南昆明 650224

收稿日期:2014-08-11 出版日期:2014-12-20 发布日期:2014-12-25
通讯作者: 信爱国, 张以芳 E-mail:aiguo_xin@hotmail.com;zyfkm@qq.com
作者简介:范斌(1988－),男,陕西人,硕士,研究方向:预防兽医学.
基金资助:
云南省科技创新人才计划项目(2011HB035);云南省重点新产品开发计划(2014BB004);云南省院士专家工作站(云科合发[2014]5号).

Development and Preliminary Application of Real-time RT-PCR Assay for Detecting Quantitation of Hog Cholera Lapinized Virus in Vaccine

FAN Bin¹, XU Wen-hua¹, HAN Jian-qiang², MA Zhi-liang¹, HU Qi³, XIN Ai-guo³, ZHANG Yi-fang¹

1. College of Animal Science and Techology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;
2. Yuxi Agricultural Vocational Technique College, Yuxi 653106, China;
3. Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Disease Laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China

Received:2014-08-11 Online:2014-12-20 Published:2014-12-25

摘要/Abstract

摘要： 为建立敏感、特异的评价猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗中病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法,参照中国猪瘟石门株兔化弱毒全长序列,在猪瘟兔化弱毒活疫苗基因组5'非编码区设计1对标准品引物、1对特异性引物和1条探针,建立检测猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法.该方法检测的敏感度达1.20×10⁵拷贝/mL;对猪繁殖与呼吸综合征、猪乙型脑炎、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病4种活疫苗基因组扩增结果均为阴性;重复性试验结果显示,批内变异系数为0.29%～0.39%,批间变异系数为0.32%～0.61%.应用此方法对6个不同厂家生产的7种猪瘟兔化弱毒活疫苗中病毒含量进行了检测,发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量存在较大差异.结果表明,建立的猪瘟兔化弱毒疫苗实时荧光定量RT-PCR方法能特异地检测疫苗病毒含量,可用于初步评价猪瘟兔化弱毒疫苗抗原含量.

关键词: 猪瘟兔化弱毒; 实时荧光定量RT-PCR; 病毒含量

Abstract: To establish a rapid, sensitive and specific method for evaluation of viral load of hog cholera lapinized virus (HCLV) vaccine, a Real-time RT-PCR assay was established using two pairs of primers and an internal TaqMan probe from the 5' non-structural region of HCLV genome. The sensitivity of the assay was 1.20×10⁵ copies/mL. The assay was specific and showed no application reaction with porcine reproductive and respiratory syndrome live vaccines, porcine epidemic encephalitis B live vaccines, swine paratyphoid and pseudorabies live vaccines. The coefficient of variation (CV) of 3 different vaccine samples of HCLV was 0.29% to 0.39% in intra-assay and 0.32% to 0.61% in inter-assay, respectively. Using this method to detect 7 different vaccines of HCLV from six different plants, the results showed that there were significant differences in viral loads among the selected HCLV vaccines. In conclusion, this Real-time RT-PCR was a highly sensitive, specific and stable method which could be applied to preliminarily evaluate the viral loads of HCLV vaccines.

Key words: hog cholera lapinized virus (HCLV); Real-time RT-PCR; viral loads

中图分类号:

S852.4

范斌, 许文花, 韩建强, 马志亮, 胡骑, 信爱国, 张以芳. 猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. , 2014, 41(12): 56-61.

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