猪圆环病毒2型ORF1基因的克隆与原核表达

›› 2013, Vol. 40 ›› Issue (11): 30-33.

猪圆环病毒2型ORF1基因的克隆与原核表达

郭颖初¹, 王开功^1,2, 周碧君^1,2, 程振涛^1,2, 文明^1,2, 温贵兰^1,2, 汪德生^1,2

1. 贵州大学动物科学学院, 贵州贵阳 550025;
2. 贵州省动物疫病研究室, 贵州贵阳 550025

收稿日期:2013-04-27 出版日期:2013-11-20 发布日期:2013-12-19
通讯作者: 王开功 E-mail:kaigongwang@yahoo.com.cn
作者简介:郭颖初(1988-),女,贵州人,硕士生,研究方向:动物疫病病原学。
基金资助:
贵州省生猪质量安全工程技术研究中心建设项目"生猪健康养殖实验室建设与技术研发"黔科合农C字(2011)4022号;贵州省农业攻关项目"贵州省猪繁殖与呼吸综合症防控研究与应用"黔科合NY字(2009)3071号;贵州省农业委员会科技计划项目"贵州省重大动物疫病省级定点监测调查研究 "2012-07号。

Cloning and Prokaryotic Expression of ORF1 Gene of Porcine Circovirus Type 2

GUO Ying-chu¹, WANG Kai-gong^1,2, ZHOU Bi-jun^1,2, CHENG Zhen-tao^1,2, WEN Ming^1,2, WEN Gui-lan^1,2, WANG De-sheng^1,2

1. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
2. Guizhou Animal Disease Institute, Guiyang 550025, China

Received:2013-04-27 Online:2013-11-20 Published:2013-12-19

摘要/Abstract

摘要： 为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni²⁺离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。

关键词: 猪圆环病毒2型; ORF1基因; 原核表达; 免疫印迹

Abstract: In order to provide a scientific basis for the diagnosis and prevention of porcine circovirus disease,ORF1 gene of porcine circovirus type 2 (PCV2) GZ strain was obtained by PCR with specific primers designed according to PCV2 sequence in GenBank. Amplification product was connected with pMD18-T vector. After the identification, subclone it into pET-30a(+) prokaryotic expression vector. It was sequenced after double enzyme identification.The results showed that the purpose fragment of ORF1 gene of PCV2 was in the right position of pET-30a(+) vector,and we successfully constructed pET30a-PCV2-ORF1 prokaryotic expression vector.The recombintant plasmid was transformed into Rosetta, expressed by IPTG induction, and detected by SDS-PAGE.It showed that PCV2-ORF1 had efficient fusion expression in the pET-30a(+) and the expressed protein was 42 ku.The expression products, which existed mainly as inclusion bodies,were purified by Ni²⁺-affinity chromatographic column.Western blotting analysis showed that the purified products could react with anti-His MAb.

Key words: porcine circovirus type 2; ORF1 gene; prokaryotic expression; Western blotting

中图分类号:

S852.65⁺9.2

郭颖初, 王开功, 周碧君, 程振涛, 文明, 温贵兰, 汪德生. 猪圆环病毒2型ORF1基因的克隆与原核表达[J]. , 2013, 40(11): 30-33.

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