数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.06.038

《中国畜牧兽医》 ›› 2017, Vol. 44 ›› Issue (6): 1847-1853.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.06.038

数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

唐连飞¹, 禹思宇¹, 周宇²

1. 湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 长沙 410004;
2. 惠州出入境检验检疫局, 惠州 516006

收稿日期:2017-01-12 出版日期:2017-06-20 发布日期:2017-06-28
通讯作者: 禹思宇 E-mail:82346418@qq.com
作者简介:唐连飞(1970-),男,湖南长沙人,博士,研究方向:动物疫病诊断和动物传染病学,E-mail:tanglf@hnciq.gov.cn
基金资助:
国家质检总局科技资助项目（2014IK243）

Establishment of Digital RT-PCR Assay for Detection of Swine Influenza Virus H3N2 Subtype

TANG Lian-fei¹, YU Si-yu¹, ZHOU Yu²

1. Inspection & Quarantine Technology Center of Hunan Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau, Changsha 410004, China;
2. Huizhou Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau, Huizhou 516006, China

Received:2017-01-12 Online:2017-06-20 Published:2017-06-28

摘要/Abstract

摘要：

试验旨在利用新型荧光探针——分子信标，建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）的H3和N2基因的保守基因序列，分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针，利用数字RT-PCR技术检测H3N2亚型SIV。结果显示，该数字RT-PCR检测方法与其他主要相关病毒均不发生交叉反应，重复性良好；对猪H3N2流感病毒而言，最低可检测到10⁶倍稀释的病毒株。数字RT-PCR方法能够对RNA模板定量分析。在H3N2 SIV的鉴定上，数字RT-PCR方法较实时荧光定量PCR方法更灵敏、准确。

关键词: 猪流感病毒; H3N2亚型; 分子信标探针; 数字RT-PCR; 实时荧光定量PCR; 灵敏性; 特异性; 重复性

Abstract:

A new assay for the detection of swine influenza virus (SIV) was developed with a novel nucleic acid probe——Molecular beacon in this study. The specific primers and molecular beacon probes were designed according to the conserved region of H3 and N2 genes of SIV H3N2 subtype. A digital RT-PCR assay was developed for detection of SIV H3N2 subtype. The results showed that SIV H3N2 subtype could be identified simultaneously on this microarry with high sensitivity and reproducibility,which could reach to 10⁶ dilute viruse. The conclusion was that the digital RT-PCR method could analyze quantitatively the RNA templates.On the identification of H3N2 SIV,the digital RT-PCR method was much more scientific than Real-time quantitative PCR method.

Key words: swine influenza virus; H3N2 subtype; molecular beacon probe; digital RT-PCR; Real-time quantitative PCR; sensitivity; specificity; repeatability

中图分类号:

S852.65⁺9.5

唐连飞, 禹思宇, 周宇. 数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(6): 1847-1853.

TANG Lian-fei, YU Si-yu, ZHOU Yu. Establishment of Digital RT-PCR Assay for Detection of Swine Influenza Virus H3N2 Subtype[J]. , 2017, 44(6): 1847-1853.

参考文献

[1] 殷震,刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版.北京:科学出版社,1997.
[2] 祁贤,陆承平.猪流感病毒进化方式及其流行特点[J].微生物学报,2009,49(9):1138-1145.
[3] 樊娇.类人源猪H3N2亚型流感病毒HA,NA遗传进化分析[J].中国兽医学报,2011,8(31):1175-1188.
[4] 宋玉慧,王翔宇,王洁琼,等. H3N2亚型猪流感病毒HA1、HA2基因的原核表达及抗原性分析[J].中国畜牧兽医,2016,43(10):2762-2767.
[5] Liu D F, Liu M, Liu C G, et al.Cloning and phylogenetic analysis of the entire gene of an H1N1 subtype swine influenza virus isolated from Guangdong province[J]. Bing Du Xue Bao, 2008, 24(5): 358-363.
[6] Kaden V, Lange E, Starick E, et al. Epidemiological survey of swine influenza A virus in selected wild boar populations in Germany[J]. Vet Microbiol, 2008, 131(1-2):123-132.
[7] 石慧花,余红梅,方桂明,等. 国内部分猪场猪流感检测情况分析[J].上海畜牧兽医通讯,2013,4:38-39.
[8] 刘丽萍,乔传玲,杨焕良,等. 2012年~2013年我国养猪重点省份猪流感的血清学调查[J].中国预防兽医学报, 2014,6:431-434.
[9] 丁耀忠,刘永生,陈豪泰,等.猪流感及生物学特性研究[J].中国农学通报, 2010,26(15):11-14.
[10] 吴斌,申翠翠,张晨曦,等.数字RT-PCR检测鲤春病毒血症的方法建立与应用[J].中国动物检疫,2015,7:72-76.
[11] 姜羽.胡佳莹.杨立桃.利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数[J].农业生物技术学报, 2014,22(10):1298-1305.
[12] 胡伟,陈荣华,张晨,等. 微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量[J].法医学杂志, 2014,30(5):342-345.
[13] 吴斌,屈菲,孙铭英. 基于数字PCR绝对定量检测技术的研究进展[J].农家科技,2014,10:157.
[14] Fang X H, Li J J, Periette J, et al. Molecular beacons:Novel fluorescent probes[J]. Anal Chem, 2000, 72(23):747A-753A.
[15] Palladino S, Kay I, Fonte R. Use of Real-time PCR and light cycler system for the rapid detection of pneumocystis carina in respiratory specimens[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2001,39(4):233-236.
[16] Tyagi S,Kramer F R. Molecular beacons: Probes that fluoresce upon hybridization[J]. Nat Biotechnol,1996,14(3):303-308.
[17] 詹成,燕丽,王琳,等. 数字PCR技术的发展和应用[J]. 复旦学报(医学版),2015,42(6):786-789.
[18] 陈艳,张春明,乔传玲,等. H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立[J] .中国兽医科学,2009,39(10):894-899.
[19] 孙忠晟,尹燕博,王平,等. SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法检测猪流感H3N2亚型病毒方法的建立[J].中国兽医杂志,2012,48(4):7-9.
[20] 王慧煜,梅琳,侯义宏,等. H1N1和H3N2亚型流感病毒基因芯片检测方法的建立[J].中国兽医科学,2011,41(12):1234-1241.
[21] 禹思宇,周宇,唐连飞,等. 分子信标荧光定量PCR检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立[J].中国动物检疫, 2015,7:67-71.

数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

Establishment of Digital RT-PCR Assay for Detection of Swine Influenza Virus H3N2 Subtype

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	麻宝艺, 盛陈艳, 刘宏莹, 马青霞, 汪婷婷, 李健明, 时坤, 杜锐, 冷雪. BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(6): 2326-2335.
[2]	吕晓楠, 徐立蒲, 张文, 王娜, 曹欢, 王小亮, 王姝, 王静波. 感染鲤浮肿病毒镜鲤的组织病理变化及病毒分布规律研究[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(3): 1077-1084.
[3]	崔宝山, 黄飞, 王杰, 李楠, 高庆华. 基于单细胞转录组测序技术筛选牛体内囊胚性别特异性基因[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(12): 4573-4581.
[4]	陶维昆, 刘波, 黄飞, 王杰, 高庆华. Xist lncRNA介导X染色体失活及应用研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(1): 216-223.
[5]	张军芳, 孙建富, 孙斌, 唐琳, 王英, 王恩泽, 崔岩, 李强, 严昌国, 李香子. 延边牛PPARγ基因的克隆及生物信息学分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(8): 2695-2704.
[6]	苗曼宁, 郭益文, 胡德宝, 曾雨晗, 李新, 张林林, 丁向彬, 郭宏. MSTN基因编辑牛肌肉转录组测序及生物信息学分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(7): 2271-2281.
[7]	李恒, 字向东. 牦牛跨膜附睾蛋白1基因的克隆及其在卵丘卵母细胞复合体中的表达分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(4): 1284-1293.
[8]	范欢欢, 王天骄, 董依萌, 李洋, 刘汇涛, 邢秀梅. 马鹿特异性SNP分子标记的验证[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(4): 1313-1322.
[9]	李建梅, 季正剑, 刘梅, 沈欣悦, 程旭, 俞燕, 戴亚斌. 藏鸡和隐性白羽鸡感染柔嫩艾美耳球虫后免疫相关基因的表达变化分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(4): 1440-1448.
[10]	陈磊, 袁枫, 贺三刚, 玛依拉, 李文蓉. 绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(2): 425-432.
[11]	戴政列, 朱静静, 陈振宇, 周晓龙, 汪涵, 李向臣, 赵阿勇, 杨松柏. 猪SENP1基因克隆、生物信息学分析与表达研究[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(12): 4382-4390.
[12]	姜懿轩, 王亚玲, 邢珊珊, 宋国华, 许会芬, 李明. 新西兰白兔MSTN基因克隆、生物信息学分析及表达谱构建[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(10): 3501-3511.
[13]	李志强, 陶晨雨, 魏奥龙, 贾青. 猪性控精子纯度实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(10): 3682-3690.
[14]	齐子成, 刘忠华. 八聚体结合转录因子4在哺乳动物早期胚胎发育中的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(10): 3715-3725.
[15]	王征帆, 朱利塞, 王娟, 李祎云, 向蕊, 应碧云, 王贵平, 贾爱卿, 白挨泉. PDCoV与TGEV双重实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(10): 3855-3863.