甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载体的构建与表达

中国畜牧兽医

甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载体的构建与表达

武立伟¹，李霆¹，杨世梅²，王慧煜¹，梅琳¹，韩雪清¹

1.中国检验检疫科学研究院，北京 100029；2.西北民族大学，甘肃兰州 730124

出版日期:2014-08-20 发布日期:2014-08-22
通讯作者: 韩雪清（1962—），甘肃人, 研究员, 主要从事病原微生物分子生物学及免疫学研究。
作者简介:武立伟（1983—），女，河北人，硕士，研究实习员，研究方向：病原微生物与分子免疫学。
基金资助:
国家重点基础研究发展计划资助项目（973项目）流感等病毒在不同宿主中的复制机制(2011CB504704-X)；基本科研业务费H7N9流感病毒非结构蛋白NS1的功能研究(2014JK007)。

Construction and Expression of NS1 Protein Eukaryotic Expression Vector of Influenza A Virus Subtype H7N9

WU Li-wei¹, LI Ting¹, YANG Shi-mei², WANG Hui-yu¹, MEI Lin¹, HAN Xue-qing¹

1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China; 2. Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730124, China

Online:2014-08-20 Published:2014-08-22

摘要/Abstract

摘要： 本试验旨在构建甲型H7N9流感病毒非结构蛋白（NS1）真核表达载体，并在293T细胞中表达其编码的NS1蛋白。首先提取安徽分离株甲型H7N9流感病毒（A/Anhui/3/2013(H7N9)）的总RNA，通过RT-PCR技术获得了甲型H7N9流感病毒H7N9 NS1全长基因，然后将其克隆至载体pcDNA4-Flag-HA中构建pcDNA4-Flag-HA-NS1真核重组表达载体，经酶切及测序鉴定正确后将质粒pcDNA4-Flag-HA-NS1转染到293T细胞中，通过Western blotting鉴定NS1蛋白的表达。结果表明成功克隆了NS1全长基因，构建了甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载pcDNA4-Flag-HA-NS1，并在293T细胞中转染表达，Western blotting确定了NS1蛋白的成功表达。该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达NS1蛋白，为后期开展流感病毒NS1蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。

关键词: 甲型H7N9流感病毒; NS1; 真核表达; Western blotting

武立伟，李霆，杨世梅，王慧煜，梅琳，韩雪清. 甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载体的构建与表达[J]. 中国畜牧兽医.

WU Li-wei, LI Ting, YANG Shi-mei, WANG Hui-yu, MEI Lin, HAN Xue-qing. Construction and Expression of NS1 Protein Eukaryotic Expression Vector of Influenza A Virus Subtype H7N9[J]. .

参考文献

1 史一博，孙建和. A型流感病毒NS1蛋白抑制IFN抗病毒作用的机制［J］. 中国人兽共患病，2007，23(10)：1030～1032.
2 刘贵生，罗青平，冯政，等. 甲型流感病毒多功能蛋白质NS1的研究进展［J］. 中国畜牧兽医，2010，37(12)：193～209.
3 孙进华，马波，于志丹，等. A型禽流感病毒NS1蛋白的表达及其诱导细胞凋亡功能的研究［J］. 中国兽医科学，2009，39(4)：287～292.
4 李建丽，张万坡，毕丁仁. A型流感病毒NS1蛋白研究进展［J］. 微生物学报，2007，47(4)：729～733.
5 范霖，马志昭，高山峨，等. 用Fugene6制作高滴度慢病毒方法的优化比较［J］. 中国细胞生物学学报，2011，33(4)：385～390.
6 段炼. 甲型流感病毒NS1蛋白功能研究进展［J］. 国外医学病毒学分册，2004，11(4)：46～49.
7 路冰，陈化兰，包红梅，等. 禽流感病毒非结构蛋白NS1在感染和免疫中的作用［J］. 中国畜牧兽医，2011，38(5)：182～185.
8 Bornholdt Z A, Prasad B V. X-ray structure of NS1 from a highly pathogenic H5N1 influenza virus［J］. Nature, 2008, 456(7224): 985～988.
9 Ehrhardt C, Ludwig S. A new player in a deadly game: Influenza viruses and the PI3K/Akt signalling pathway［J］. Cellular Microbiology, 2009, 11(6): 863～871.
10 Ehrhardt C, Wolff T, Pleschka S, et al. Influenza A virus NS1 protein activates the PI3K/Akt pathway to mediate antiapoptotic signaling responses［J］. J Virol, 2007, 81(7): 3058～3067.
11 Garcia-Sastre A, Egorov A, Matassov D, et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems［J］. Virology, 1998, 252(2): 324～330.
12 Hale B G, Randall R E, Ortín J, et al. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses［J］. Journal of General Virology, 2008, 89(10): 2359～2376.
13 Han X, Li Z, Chen H, et al. Influenza virus A/Beijing/501/2009 (H1N1) NS1 interacts with β-tubulin and induces disruption of the microtubule network and apoptosis on A549 cells［J］. PLoS One, 2012, 7(11): e48340.
14 Krug R M, Yuan W, Noah D L, et al. Intracellular warfare between human influenza viruses and human cells: The roles of the viral NS1 protein ［J］. Virology, 2003, 309(2): 181～189.
15 Lam W Y, Tang J W, Yeung A C M, et al. Avian influenza virus A/HK/483/97 (H5N1) NS1 protein induces apoptosis in human airway epithelial cells［J］. Journal of Virology, 2008, 82(6): 2741～2751.
16 Li Q, Zhou L, Zhou M, et al. Preliminary report: Epidemiology of the avian influenza A (H7N9) outbreak in China［J］. N Engl J Med, 2014 370(6): 520～532.
17 Liu D, Shi W, Shi Y, et al. Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection: Phylogenetic, structural, and coalescent analyses［J］.Lancet, 2013, 381(9881): 1926～1932.
18 Liu J, Lynch P A, Chien C Y, et al. Crystal structure of the unique multifunctional RNA-binding domain of the influenza virus NS1 protein［J］. Nat Struct Biol, 1997, 4(11): 896～899.
19 Min J Y, Li S D, Sen G C, et al. A site on the influenza A virus NS1 protein mediates both inhibition of PKR activation and temporal regulation of viral RNA synthesis［J］. Virology, 2007, 363(1): 236～243.
20 Schultz-Cherry S, Dybdahl-Sissoko N, Neumann G, et al. Influenza virus ns1 protein induces apoptosis in cultured cells［J］. Journal of Virology, 2001, 75(17): 7875～7881.
21 Seo S H, Webster R G. Tumor necrosis factor alpha exerts powerful antinfluenza virus effects in lung epithelial cells ［J］. Virol, 2002, 76(3): 1071～1076.
22 Twu K Y, Noah D L, Rao P, et al. The CPSF30 binding site on the NS1A protein of influenza A virus is a potential antiviral target［J］. Journal of Virology, 2006, 80(8): 3957～3965.
23 Yang N, Hong X, Yang P, et al. The 2009 pandemic A/Wenshan/01/2009 H1N1 induces apoptotic cell death in human airway epithelial cells［J］. J Mol Cell Biol, 2011 3(4): 221～229.
24 Zhao L, Xu L, Zhou X, et al.Interaction of influenza virus NS1 protein with growth arrest-specific protein 8［J］.Virology Journal, 2009, 6(1): 218～226.

[1]	潘鹏丞, 雷宗全, 李显, 胡湘云, 秦谦涛, 覃兆鲜, 关志惠, 陈宝剑, 谢炳坤. 陆川猪MYL2基因生物信息学分析、真核表达载体构建及组织表达研究[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(5): 1796-1806.
[2]	白少成, 周娟, 靳荣帅, 王璠, 卢婷婷, 汤先伟, 赵博昊, 吴信生, 陈阳. 新西兰白兔CYP11A1基因的克隆、生物信息学分析及其对繁殖相关基因的影响[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(7): 2484-2496.
[3]	邹剑伟, 邹菊红, 申玉建, 韦一, 张叁保, 连子童, 徐建建, 宋颖, 黄艳娜, 韦英明, 蒋钦杨, 郑自华. 努比亚山羊LMCD1基因生物信息学分析、真核表达载体的构建及表达[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(6): 2033-2042.
[4]	董媛, 于鸿绪, 陈国良, 鲍东博, 崔嘉芮, 刘磊, 王会岩. 牛妊娠相关蛋白19真核表达载体的构建及生物信息学分析[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(4): 1233-1243.
[5]	庞峰, 龙琴琴, 梁绍波, 成虹松, 程振涛. 羊口疮病毒ORFV114蛋白生物信息学分析、真核表达及亚细胞定位[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(11): 4150-4158.
[6]	曹颖颖, 李慧君, 李宝莹, 梁亮, 冷静, 唐海波. 瑶山亚种树鼩ISG15蛋白表达及其多克隆抗体制备[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(1): 273-282.
[7]	胡换仪, 汪建中, 刘昌锦, 林敏, 刘小兰, 魏黄思梧, 邓舜洲. 绿色荧光蛋白的真核表达及其单克隆抗体制备[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(1): 328-337.
[8]	乔连江, 陈晨, 张如, 崔立恒, 徐丽, 杨艳玲. RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因真核表达载体构建及生物信息学分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(7): 2313-2323.
[9]	邹菊红, 申玉建, 高小童, 黄艳娜, 蒋钦杨. 努比亚山羊脂肪和肥胖相关蛋白基因克隆分析及真核表达载体构建[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(7): 2342-2348.
[10]	焦文强, 刘运超, 邢广旭, 陈鹏举, 徐引弟, 王治方, 张青娴, 许峰. 猴源葡萄糖调节蛋白78生物信息学分析及其真核表达[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(4): 1170-1178.
[11]	赵泓淙, 高登科, 江海圳, 李雅婷, 李丹, 马白荣, 靳亚平, 陈华涛. 山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(12): 4327-4338.
[12]	潘鹏丞, 温斌华, 谢婉, 姜长津, 焦迪, 陈宝剑, 关志惠, 谢炳坤. 陆川猪PDK4基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(8): 2337-2347.
[13]	王召阳, 蒋亚君, 刘雪婷, 林伟东, 鑫婷, 侯绍华, 郭晓宇, 朱鸿飞, 贾红. 抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(6): 1685-1693.
[14]	吕阳, 曹阳, 高一, 刘理想, 薛佳佳, 张国梁. 草原红牛AIDA基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体的构建[J]. 《中国畜牧兽医》, 2019, 46(8): 2193-2202.
[15]	宋天琪, 侯绍华, 郭晓宇, 鑫婷, 姜一曈, 袁维峰, 朱鸿飞, 贾红. 重组犬α6干扰素的酵母表达及其抗病毒活性评价[J]. 《中国畜牧兽医》, 2019, 46(7): 2144-2150.