张涛1,2,王金玉1,2,张跟喜1,2,王文浩1,2,魏岳1,2,陈学森1,2,唐莹1,2,王永娟3
ZHANG Tao1,2, WANG Jin-yu1,2, ZHANG Gen-xi1,2, WANG Wen-hao1,2, WEI Yue1,2, CHEN Xue-sen1,2, TANG Ying1,2, WANG Yong-juan3
(1. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;2. Key Laboratory for Animal Genetics, Breeding, Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province, Yangzhou 225009, China; 3. Jiangsu Jinghai Poultry Group Co., Ltd., Nantong 226103, China)
摘要: 本试验根据GenBank公布的原鸡(Gallus gallus)促性腺激素释放激素1(gonadotropin releasing hormone 1,GnRH1)基因mRNA序列设计1对引物,采用RT-PCR方法,从京海黄鸡下丘脑组织克隆GnRH1基因编码区序列,对其进行生物信息学分析,并构建原核表达载体pET32a-GnRH1,在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达。最终获得了包括编码区、大部分启动子区和部分3′区域在内的长度为352 bp京海黄鸡GnRH1基因序列,该核酸序列与火鸡、鸽子、人、牛、野猪、山羊、绵羊、藏羚羊、马和大鼠的GnRH1基因序列同源性分别为93%、81%、54%、58%、61%、76%、76%、59%、76%和66%。酶切测序鉴定结果显示,成功构建了原核表达载体pET32a-GnRH1;SDS-PAGE检测结果显示,构建的重组质粒在大肠杆菌BL21感受态细胞中成功表达,分子质量为25~28 ku,且上清表达量高于沉淀;Western blotting检测结果显示,在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达的蛋白为目的蛋白,且主要为可溶性表达。结果表明,成功克隆了京海黄鸡GnRH1基因,构建了GnRH1原核表达体系,并成功表达目的蛋白,为后续相关研究打下了基础。