小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

中国畜牧兽医

小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

赵文华，杨仕标，高华峰，王金萍

（云南省畜牧兽医科学院,云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

收稿日期:2013-08-28 出版日期:2014-03-20 发布日期:2014-05-15
通讯作者: 杨仕标，研究员。E-mail:yangsb3799@sina.com
作者简介:赵文华（1974—），女，山东人，博士，副研究员，研究方向：动物分子病毒学。
基金资助:
云南省应用基础研究面上项目（2009ZC182M）；公益性行业(农业)科研专项 (200903037)。

Development of the Duplex Real-time RT-PCR Assay with TaqMan Probe of N-ITR Genes for Detection of Peste des Petits Ruminants Virus and Goat Pox Virus

ZHAO Wen-hua, YANG Shi-biao, GAO Hua-feng, WANG Jin-ping

(Yunnan Tropical and Subtropical Animal Viral Disease Laboratory, Yunnan Academy of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Kunming 650224, China)

Received:2013-08-28 Online:2014-03-20 Published:2014-05-15

摘要/Abstract

摘要： 为实现山羊2种疫病病原体——小反刍兽疫病毒（PPRV）和山羊痘病毒（GTPV）的同步快速检测，基于PPRV的N基因及GTPV的ITR基因，分别设计合成2套特异性引物及探针；探针分别用5′FAM-TAMRA3′及5′JOE-Eclipse3′标记物进行标记以实现同步检测。试验结果显示，所建立的N-ITR二联探针实时荧光定量RT-PCR方法可同步检测PPRV和GTPV，产生特异性荧光信号，而对禽痘病毒（FPV）、犬瘟热病毒(CDV) 等相关病毒无荧光信号检出。以PPRV-N和GTPV-ITR的pMD18-T 载体质粒为标准品，构建了二联标准曲线，N-ITR探针对PPRV和GTPV的检测敏感度可分别达10²和10³拷贝/μL。本研究初步建立了可同步快速特异性检测PPRV和GTPV的二联实时荧光定量RT-PCR方法。

关键词: 小反刍兽疫病毒; 山羊痘病毒; 二联实时荧光定量RT-PCR; 探针

Abstract: Peste des petits ruminants virus (PPRV) and goat pox virus (GTPV) are the causative agents of two kinds of goats’ diseases—peste des petits ruminants and goat pox which can cause disaster economic losses. In order to detect the two viruses simultaneously and quickly, two sets of primers and relative probes were designed based on the nucleoprotein (N) gene of PPRV and the inverted terminal repeat (ITR) segment of GTPV， respectively. In order to work together in the same reaction, the probes were labeled with different fluorescent materials 5′FAM-TAMRA3′and 5′JOE-Eclipse3′，respectively. Results showed that the duplex Real-time RT-PCR assay was identified to be specific for PPRV and GTPV only and specific fluorescent signal could be detected, but the related viruses including fowl pox virus（FPV）and canine distemper virus (CDV) had no specific fluorescent signal. Positive recombinant plasmids (PPRV pMD18-T-N and GTPV pMD18-T-ITR) were built and used for positive quantitative templates to establish duplex standard curves. The developed assay based on the probe N-ITR was found to be highly specific and sensitive with a detection limit of 10² copies/μL cDNA and 10³ copies/μL DNA for PPRV and GTPV， respectively. Finally, the duplex Real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of PPRV and GTPV was established preliminarily in the study.

Key words: peste des petits ruminants virus (PPRV); goat pox virus (GTPV); duplex Real-time RT-PCR; probe

赵文华，杨仕标，高华峰，王金萍. 小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医.

ZHAO Wen-hua, YANG Shi-biao, GAO Hua-feng, WANG Jin-ping. Development of the Duplex Real-time RT-PCR Assay with TaqMan Probe of N-ITR Genes for Detection of Peste des Petits Ruminants Virus and Goat Pox Virus[J]. .

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