H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

›› 2014, Vol. 41 ›› Issue (11): 63-68.

H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

刘好朋¹, 胡京京¹, 唐续¹, 裴仉福¹, 李冰¹, 李琳¹, 陈瑞爱^1,2, 贺东生^1,2

1. 广东大华农动物保健品股份有限公司, 广东新兴 527400;
2. 华南农业大学兽医学院, 广东广州 510642

收稿日期:2014-06-04 出版日期:2014-11-20 发布日期:2014-12-06
通讯作者: 贺东生 E-mail:dhe@scau.edu.cn
作者简介:刘好朋(1985-),男,山东人,硕士,研究方向:预防兽医学。
基金资助:
企业基金项目—大华农基金项目(03-63C201206-2)。

Development and Application of One-step Real-time Fluorescent Quantitative RT-PCR Assay for Rapid Detection of H1 Subtype Swine Influenza Virus

LIU Hao-peng¹, HU Jing-jing¹, TANG Xu¹, PEI Zhang-fu¹, LI Bing¹, LI Lin¹, CHEN Rui-ai^1,2, HE Dong-sheng^1,2

1. Guangdong Dahuanong Animal Health Product Co., Ltd., Xinxing 527400, China;
2. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China

Received:2014-06-04 Online:2014-11-20 Published:2014-12-06

摘要/Abstract

摘要： 为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达10²拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。

关键词: 猪流感病毒; H1亚型; TaqMan MGB探针; 一步法实时荧光定量RT-PCR

Abstract: To establish a rapid, simple and accurate method to diagnose and detect H1 subtype swine influenza virus (SIV), the specific primers and TaqMan MGB probe were designed according to the conserved region of HA gene of H1 subtype SIV. A one-step Real-time fluorescent quantitative RT-PCR assay was developed for detection of H1 subtype SIV. A series of dilutions of recombinant plasmids pMD18-H1 were prepared and used to generate standard curves. The results showed that the one-step Real-time fluorescent quantitative RT-PCR was capable of detecting 10² copies of H1 subtype SIV per microliter. The results were negative for the detection of H3N2 and H9N1 subtypes SIV, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine epidemic diarrhea virus, transmissible gastroenteritis virus. The coincidence rates between one-step Real-time fluorescent quantitative RT-PCR and virus isolation were 94%. The method was highly specific and sensitive, and could be used for rapid quantitative detection of H1 subtype SIV.

Key words: swine influenza virus; H1 subtype; TaqMan MGB probe; one-step Real-time fluorescent quantitative RT-PCR

中图分类号:

刘好朋, 胡京京, 唐续, 裴仉福, 李冰, 李琳, 陈瑞爱, 贺东生. H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. , 2014, 41(11): 63-68.

LIU Hao-peng, HU Jing-jing, TANG Xu, PEI Zhang-fu, LI Bing, LI Lin, CHEN Rui-ai, HE Dong-sheng. Development and Application of One-step Real-time Fluorescent Quantitative RT-PCR Assay for Rapid Detection of H1 Subtype Swine Influenza Virus[J]. , 2014, 41(11): 63-68.

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