H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2016.12.003

《中国畜牧兽医》 ›› 2016, Vol. 43 ›› Issue (12): 3101-3106.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2016.12.003

H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

李丹¹, 谢芝勋², 宋德贵¹, 李孟², 谢志勤², 罗思思², 谢丽基², 黄莉², 范晴², 黄娇玲²

1. 广西师范大学生命科学学院, 桂林 541000;
2. 广西壮族自治区兽医研究所, 广西兽医生物技术重点实验室, 南宁 530001

收稿日期:2016-04-25 出版日期:2016-12-20 发布日期:2016-12-22
通讯作者: 谢芝勋 E-mail:xiezhixun@126.com
作者简介:李丹(1990-),女,广西桂林人,硕士生,研究方向:微生物学,E-mail:1176231278@qq.com
基金资助:
国家“万人计划”领军人才专项（2016-37-88）；广西科技项目（2013GXNSFDA019015、AD163800009、14123001-8）；广西水产畜牧局科研项目（桂渔牧科201204930、201452001）

Development of a Duplex RT-PCR Assay for Detection of H9 and H6 Subtype AIV

LI DAN¹, XIE Zhi-xun², SONG De-gui¹, LI Meng², XIE Zhi-qin², LUO Si-si², XIE Li-ji², HUANG Li², FAN Qing², HUANG Jiao-ling²

1. College of Life Sciences, Guangxi Normal University, Guilin 541000, China;
2. Guangxi Key Laboratory of Vetrinary Biotechnology, Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning 530001, China

Received:2016-04-25 Online:2016-12-20 Published:2016-12-22

摘要/Abstract

摘要：

试验旨在建立可同时鉴别检测H9和H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）的二重RT-PCR方法。根据GenBank中H9和H6亚型AIV的HA基因保守序列，分别设计2对特异性引物，优化引物浓度与退火温度等条件，建立了可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。用该法对H9和H6亚型AIV混合感染样品、H9亚型AIV单一感染样品和H6亚型AIV单一感染样品进行扩增，结果均得到对应的目的条带，而对其余亚型AIV及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。该法对H9和H6亚型AIV的检测下限均为5×10⁴拷贝/μL。本研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、稳定性和重复性良好，可同时鉴别检测H9与H6两种亚型AIV，为H9与H6亚型AIV的监测提供技术支撑。

关键词: 禽流感病毒; H9亚型; H6亚型; 二重RT-PCR

Abstract:

This experiment was aimed to develop a method for simultaneous detection of H9 and H6 subtype avian influenza virus (AIV).Two pairs of specific primers were designed according to the conserved regions sequences of H6 and H9 AIV HA gene,a duplex RT-PCR simultaneous detection of H9 and H6 subtype AIV was developed by optimizing the PCR system such as the concentration of different primers and annealing temperature.It showed that all samples could be amplified specific bands from H9 subtype AIV single infection samples or H6 subtype AIV single infection samples,and the samples mix infection these two subtypes AIV.No specific bands of the same sizes were amplified from genomic materials of other avian pathogens.The detection limit of the duplex RT-PCR was 5×10⁴ copies/μL. It suggested that this duplex RT-PCR assay was a specific,sensitive,stable and repeatable method for detection of H9 and H6 subtype of AIV,and could provide technical support for the monitoring of H9 and H6 subtype AIV.

Key words: avian influenza virus; H9 subtype; H6 subtype; duplex RT-PCR

中图分类号:

S852.65

李丹, 谢芝勋, 宋德贵, 李孟, 谢志勤, 罗思思, 谢丽基, 黄莉, 范晴, 黄娇玲. H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立[J]. 《中国畜牧兽医》, 2016, 43(12): 3101-3106.

LI DAN, XIE Zhi-xun, SONG De-gui, LI Meng, XIE Zhi-qin, LUO Si-si, XIE Li-ji, HUANG Li, FAN Qing, HUANG Jiao-ling. Development of a Duplex RT-PCR Assay for Detection of H9 and H6 Subtype AIV[J]. , 2016, 43(12): 3101-3106.

参考文献

[1] Tong S, Zhu X, Li Y, et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses[J]. PLoS Pathog, 2013, 9(10):e1003657.
[2] Webster R G, Air G M, Metzger D W, et al. Antigenic structure and variation in an influenza virus N9 neuraminidase[J]. J Virol,1987,61(9):2910-2916.
[3] Xie Z, Xie L, Zhou C, et al. Complete genome sequence analysis of an H6N1 avian influenza virus isolated from Guangxi pockmark ducks[J].J Virol,2012, 86(24):13868-13869.
[4] 罗思思,谢芝勋,谢志勤,等. H6N1亚型禽流感病毒二重荧光RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医,2016,43(2):326-332.
[5] 甘孟侯. 禽流感[M]. 北京:北京农业大学出版社, 2002.
[6] Liu D, Shi W, Shi Y,et al. Origin and diversity of novelavian influenza A H7N9 viruses causing human infection:Phylogenetic, structural, and coalescent analyses[J]. Lancet,2013, 381(9881):1926-1932.
[7] Chen H, Yuan H, Gao R,et al. Clinical and epidemiological characteristics of a fatal case of avian influenza A H10N8 virus infection:A descriptive study[J]. Lancet, 2014, 383(9918):714-721.
[8] Liu D, Shi W, Gao G F. Poultry carrying H9N2 act as incubators for novel human avian influenza viruses[J]. Lancet, 2014, 383(9920):869.
[9] Xu W, Li X, Bai T, et al. A fatal case of infection with a further reassortant, highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5N6 virus in Yunnan, China[J]. Infect Genet Evol, 2016, 40:63-66.
[10] Chin P S,Hoffmann E, Webby R, et al. Molecular evolution of H6 influenza viruses from poultry in Southeasterm China:prevalence of H6N1 influenza viruses possessing seven A/Hong Kong/156/97(H5N1)-like genes in poultry[J]. J Virol, 2002, 76(2):507-516.
[11] Yuan J, Zhang L, Kan X Z, et al. Origin and molecular characteristics of a novel 2013 avian influenza A(H6N1) virus causing human infection in Taiwan[J].Clin Infect Dis, 2013,57(9):1367-1368.
[12] 陈妍梅, 葛万运, 黄川, 等. 广西健康青年H9、H6亚型禽流感病毒血清抗体调查[J]. 中国热带医学, 2008,6:985-986.
[13] 梁庆, 李景东, 陈煜生, 等. 潮汕地区健康青年H9、H6、H5亚型甲型流感病毒血清抗体调查[J]. 汕头大学医学院学报, 2003, 2:107-108.
[14] 罗思思,谢芝勋,谢志勤,等. H6N1亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立[J]. 畜牧与兽医,2015,47(8):24-27.
[15] 刘志杰,李如举,曾智勇,等. 多重PCR反应的影响因素及其优化[J]. 黑龙江畜牧兽医,2011,13:26-28.
[16] Peng Y,Xie Z X, Liu J B, et al. Epidemiological surveillance of low pathogenic avian influenza virus (LPAIV) from poultry in Guangxi province, Southern China[J].PLoS One, 2013, 8(10):e77132.
[17] Hoffmann E, Stech J, Guan Y, et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J]. Arch Virol, 2001, 146(12):2275-2289.
[18] Fusaro A, Monne I, Salviato A, et al.Phylogeography and evolutionary history of reassortant H9N2 viruses with potential human health implications[J]. J Virol, 2011, 85(16):8413-8421.
[19] 范胜涛. 野鸟禽流感监测及哺乳动物跨种传播能力评估[D].北京:北京协和医学院,2014.
[20] 赵国,刘晓文,钱忠明,等. 2002-2009年中国华东地区家禽低致病性禽流感的病原学检测与分析[J].中国农业科学,2011,44(1):153-159.
[21] 刘婷婷,谢芝勋,宋德贵,等. H3亚型禽流感病毒巢式PCR检测方法的建立[J].中国畜牧兽医,2014,41(11):85-89.
[22] 徐倩,谢芝勋,谢丽基,等. 禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医,2014,41(11):58-62.

H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

Development of a Duplex RT-PCR Assay for Detection of H9 and H6 Subtype AIV

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	龙凤, 谢守玉, 崔鹏飞, 施开创, 韦显凯, 冯淑萍, 屈素洁, 陆文俊, 李剑锋, 尹彦文, 邓国华. 2016－2021年广西H9亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传进化动态分析[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(5): 1947-1958.
[2]	谢守玉, 王睿敏, 崔鹏飞, 施开创, 韦显凯, 冯淑萍, 龙凤, 屈素洁, 陆文俊, 黄金山, 黄凤梅, 温新瑞, 尹彦文, 邓国华. 2株海鸭源H3亚型禽流感病毒全基因组分子特征分析[J]. 中国畜牧兽医, 2023, 50(4): 1319-1328.
[3]	杨景, 张新宇, 梁志鹏, 程晴, 王聪颖, 池仕红, 袁生, 郭锦玥, 黄淑坚, 温峰. H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备[J]. 中国畜牧兽医, 2022, 49(10): 3963-3971.
[4]	江宁, 尹航, 张岩威, 李紫馨, 池晓娟, 王松. H9N2亚型禽流感病毒与其他病原混合感染的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(9): 3447-3455.
[5]	尹彦文, 施开创, 孙文超, 谢守玉, 屈素洁, 陆文俊, 王露霞, 覃勇, 裴幸彪, 凌丹. 2013－2019年广西边境地区低致病性禽流感病毒监测分析[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(8): 3002-3009.
[6]	程邓芳, 梅晨, 刘娟, 王宏俊, 先宏. 中药复方对H9N2亚型禽流感病毒在MDCK细胞增殖的作用[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(2): 650-657.
[7]	李青梅, 郭军庆, 孟泽锟, 李艳华, 刘肖, 石建州, 李鸽, 柴书军, 罗俊, 邓瑞广, 张改平. H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用[J]. 中国畜牧兽医, 2021, 48(10): 3761-3769.
[8]	程艺, 田辉, 张亚, 薛景景, 盛东北, 刘武杰, 王婉冰, 张盼涛, 田克恭. H9亚型禽流感病毒HF株的分离鉴定和免疫原性评价[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(9): 2945-2952.
[9]	李佳佳, 李素华, 宋建领, 黄景军, 缪渊, 陈曦, 季佳. 2株云南H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因序列分析[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(3): 873-883.
[10]	彭成成, 吴熠潇, 刘旭平, 谭文松. H9N2亚型禽流感病毒纯化及病毒HA蛋白定量方法研究[J]. 《中国畜牧兽医》, 2019, 46(7): 2069-2078.
[11]	熊文婕, 谢芝勋, 李孟, 曹国敏, 覃海, 严小东. 一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(2): 310-319.
[12]	程邓芳, 王红均, 黄庆洲, 张莉, 刘娟, 先宏. 海藻硫酸多糖和中药复方对鸡胚接种H9N2亚型禽流感病毒的作用[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(12): 3594-3600.
[13]	万润, 华敏, 龙立书, 贺欣薇, 罗引幸, 周碧君, 王开功, 程振涛, 文明. H6N6亚型禽流感病毒N6基因的原核表达与多克隆抗体制备[J]. 《中国畜牧兽医》, 2018, 45(11): 2989-2995.
[14]	何莹, 谢芝勋, 罗思思, 李孟, 谢丽基, 邓显文, 谢志勤, 奉彬, 黄娇玲, 张艳芳. 禽流感病毒与鸡细小病毒二重PCR检测方法的建立[J]. 《中国畜牧兽医》, 2017, 44(7): 2126-2131.
[15]	马萍, 李达, 汤德元, 张元鑫, 张华, 曾智勇, 刘霞, 韦冠东. 鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的单一与二重RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 《中国畜牧兽医》, 2016, 43(9): 2230-2239.