靶向食蟹猴NTCP基因的CRISPR/Cas9系统gRNA筛选

doi:10.16431/j.cnki.1671-7236.2016.10.010

《中国畜牧兽医》 ›› 2016, Vol. 43 ›› Issue (10): 2572-2577.doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2016.10.010

靶向食蟹猴NTCP基因的CRISPR/Cas9系统gRNA筛选

徐桂利^1,2, 高新², 刘铮铸¹, 巩元芳¹, 宋海峰²

1. 河北科技师范学院动物科技学院, 秦皇岛 066004;
2. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京 100850

收稿日期:2016-04-22 出版日期:2016-10-20 发布日期:2016-10-28
通讯作者: 刘铮铸, 宋海峰 E-mail:liuzhengzhu@163.com;bapklab@yahoo.com
作者简介:徐桂利(1986-),男,山东临沂人,硕士生,研究方向:动物分子遗传,E-mail:296881485@163.com
基金资助:
国家“重大新药创制”科技重大专项：生物类似药非临床与临床研究的药代动力学、药效动力学以及免疫原性评价的关键技术（2015ZX09501008-006）

gRNA Screening of CRISPR/Cas9 System Targeting Macaca fascicularis NTCP Gene

XU Gui-li^1,2, GAO Xin², LIU Zheng-zhu¹, GONG Yuan-fang¹, SONG Hai-feng²

1. College of Animal Science and Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao 066004, China;
2. Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China

Received:2016-04-22 Online:2016-10-20 Published:2016-10-28

摘要/Abstract

摘要：

本研究旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法及细胞水平上的PCR扩增测序筛选出靶向食蟹猴NTCP基因具有高敲除活性的gRNA。首先通过比对食蟹猴与人类NTCP氨基酸序列，选择差异位点，即第84—87位和第157—165位氨基酸作为基因靶点序列区；利用gRNA软件设计针对上述基因靶点序列的gRNA，每个靶点设计3~4条候选gRNA序列；然后利用gRNA体外检测试剂盒，筛选出靶向NTCP基因的体外敲除活性较高的两条gRNA序列：gRNA1.2和gRNA2.1。将gRNA1.2和gRNA2.1分别插入pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP载体中，转染食蟹猴原代肝细胞。提取转染后细胞基因组DNA，通过PCR扩增NTCP基因并将其克隆到T载体中进行测序分析。结果表明，gRNA1.2和gRNA2.1均可使NTCP基因产生移码突变，但gRNA2.1比gRNA1.2具有更高的敲除活性。本研究为下一步编辑食蟹猴NTCP基因及研究其在乙型肝炎病毒（HBV）感染中的功能奠定了基础。

关键词: CRISPR/Cas9; gRNA; 食蟹猴; NTCP基因; 基因敲除

Abstract:

This study was aimed to screen gRNA of efficient knockout activity targeting Macaca fascicularis NTCP gene by the CRISPR/Cas9 enzyme digestion method and PCR amplification methods in vitro.Comparing NTCP gene sequences between Macaca fascicularis and human,the sequences of NTCP gene coding amino acid 84 to 87 and 157 to 165 were chosen as gene knockout targets.3 to 4 candidate gRNA sequences were designed in two target sequence regions through gRNA software.By screening cleavage activity targeting NTCP gene in vitro,gRNA1.2 and gRNA2.1 were selected and inserted into pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP plasmid,respectively.The genome DNA was extracted from primary hepatocytes after gRNA1.2 and gRNA2.1 being transferred,respectively.Then NTCP sequences were amplified by PCR and sequenced by being cloned into T vector.The results indicated that compared to gRNA1.2,gRNA2.1 had much higher activity to make a frame-shift mutation in NTCP gene.This study laid a theoretical foundation for further editing NTCP gene and its biological function in Macaca fascicularis.

Key words: CRISPR/Cas9; gRNA; Macaca fascicularis; NTCP gene; gene knockout

中图分类号:

徐桂利, 高新, 刘铮铸, 巩元芳, 宋海峰. 靶向食蟹猴NTCP基因的CRISPR/Cas9系统gRNA筛选[J]. 《中国畜牧兽医》, 2016, 43(10): 2572-2577.

XU Gui-li, GAO Xin, LIU Zheng-zhu, GONG Yuan-fang, SONG Hai-feng. gRNA Screening of CRISPR/Cas9 System Targeting Macaca fascicularis NTCP Gene[J]. , 2016, 43(10): 2572-2577.

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gRNA Screening of CRISPR/Cas9 System Targeting Macaca fascicularis NTCP Gene

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